Ich freue mich, Ihnen den nächsten Redner vorzustellen,
Herrn Professor Robert Huber vom Max-Planck-Institut für Biochemie in Martinsried.
Er erhielt 1988 zusammen mit Deisenhofer und Michel den Chemie-Nobelpreis
für “die Bestimmung der dreidimensionalen Struktur eines photosynthetischen Reaktionszentrums”.
Das markierte auch die erste Kristallisations- und Strukturanalyse eines Membranproteins.
Ich erinnere mich noch an diese spannende Zeit, nicht nur wegen der Leute, die sich mit Photosynthese beschäftigten,
sondern wegen der Biochemie, Biophysik und medizinischen Forschung im Allgemeinen.
Professor Huber spricht heute über verwandte Themen:
die Proteolyse, ihre Regulation und molekulare Basis
(Applaus).
Was Sie hier sehen, ist das Gesicht eines emeritierten Professors, der immer noch nicht gelernt hat nein zu sagen.
Ich freue mich sehr, in Lindau, dieser wunderschönen Stadt in meiner bayerischen Heimat, zu sein und Studenten zu treffen,
um ihnen mein Fachgebiet, die Proteinkristallographie, näherzubringen
und vielleicht sogar einige von ihnen davon zu überzeugen, sich mit diesem Gebiet näher zu beschäftigen.
Mein Vorredner, Herr Professor Blobel, hat mit seinem Vortrag, den ich mit großem Interesse verfolgt habe,
hervorragende Werbung für die Proteinkristallographie gemacht – daran möchte ich gerne anknüpfen.
Es handelt sich bei diesem Thema um ein relativ junges Forschungsgebiet,
dessen Vater der im englischen Cambridge tätige Max Perutz ist.
In den letzten 20 Jahren haben auf diesem Gebiet jedoch aufgrund der technischen und methodischen Entwicklungen,
die eigentlich aus ganz anderen Bereichen wie der Gentechnik, rekombinanten Proteinen, der Hochenergiephysik,
dem Computerwesen und der graphischen Datenverarbeitung stammen, große Veränderungen stattgefunden.
Ich werde nicht über die Proteinkristallographie referieren,
sondern möchte die Ergebnisse und biologischen Auswirkungen dieser hochauflösenden Proteinstrukturen für sich sprechen lassen,
wie Sie das in Herrn Blobels Vortrag bereits so schön gesehen haben.
Ich habe als System die Proteasen gewählt – damit beschäftigte ich mich seit Ende der 60er Jahre.
Natürlich habe ich während meiner Laufbahn auch zahlreiche andere Themen verfolgt und mit anderen Systemen gearbeitet –
am bekanntesten sind wohl die Proteine der Photosynthese,
für die ich 1988 zusammen mit Hartmut Michel und meinem damaligen Doktoranden Johann Deisenhofer den Nobelpreis erhalten habe.
Doch zurück zu den Proteasen.
Eine ganz einfache chemische Reaktion, die Hydrolyse einer Peptidbindung.
Dafür ist, wie Sie wissen, eine heiße Säure oder Base notwendig, doch in der Natur gibt es Enzyme,
und zwar überraschenderweise viele.
Etwa 3% aller Gene in der Tier- und Pflanzenwelt sowie in Bakterien kodieren Proteinasen.
Abgesehen von der Anzahl der existierenden Proteasen sind vor allem ihre vielfältigen Strukturen und Mechanismen einzigartig.
Für gewöhnlich werden sie nach dem Hauptnukleophil eingeteilt – Serin, Threonin, Metalloproteinasen.
Doch auch innerhalb dieser Gruppen gibt es Unterschiede.
Klassisch ist das gemeinsame Prinzip, der gemeinsame Mechanismus der trypsin-artigen Proteasefamilie
und der subtilisin-artigen Proteasefamilie – Proteasen, die keinerlei Bezug zueinander haben,
aber derselben Proteolyse, demselben Proteolysemechanismus unterliegen.
Nun, der Grund für diese Fülle und Vielfalt der Proteasen liegt in ihrer Beteiligung an physiologischen Prozessen.
Einen solchen Prozess zeige ich Ihnen hier.
Es handelt sich um die Blutgerinnungskaskade,
die über eine Reihe von Aktivierungsschritten mit begrenzter proteolytischer Aktivität von der Wunde bis zum Thrombus führt.
Natürlich ist dieser Prozess stark reguliert.
Es gibt Inhibitoren und Komponenten, die ihnen entgegenwirken.
Auf eine von ihnen, das Protein C, werde ich später noch zurückkommen.
Nun, die letzte Komponente, diejenige, die durch Spaltung von Fibrinogen den Thrombus bildet, heißt Faktor II oder Thrombin.
Ich werde sie im Laufe meines Vortrags immer wieder als Beispiel verwenden.
Die Vielfalt, die uns bei den Proteasen begegnet, liegt also darin begründet,
dass die begrenzte Proteolyse einen wichtigen physiologischen Regulationsmechanismus darstellt.
Diese Vielfalt der proteolytischen Strukturen und Mechanismen
korreliert mit den zahlreichen Möglichkeiten zur Regulation der proteolytischen Aktivität.
Das ist das Thema meines Vortrags heute Morgen.
In diesem Schema habe ich versucht, die verschiedenen Grundprinzipien der Regulation der Protease-Aktivität zu kategorisieren.
Ich werde sie nacheinander durchgehen und Ihnen jeweils Beispiele geben.
Ich beginne mit der einfachsten Regulation, nämlich der Inhibition einer Protease durch ein Protein,
das zu der Substratbindungsstelle sterisch komplementär ist.
Es handelt sich, wie wir festgestellt haben, um das erste Beispiel aus den späten 60er, frühen 70er Jahren.
Hier sehen Sie Trypsin in einem Komplex mit dem basischen pankreatischen Trypsin-Inhibitor.
Wir untersuchten nicht nur den Komplex als solchen, sondern auch die einzelnen Komponenten, und stellten fest,
dass es bei der Kombination der beiden Komponenten außer geringfügigen Bewegungen in peripheren Seitenketten
nicht zu Strukturveränderungen kam, sondern eine bereits ausgebildete strukturelle Komplementarität bestand.
Später befassten wir uns mit anderen Proteaseklassen.
Das hier ist die Serinprotease-Klasse, hier haben wir die trypsin-artigen Proteinasen,
hier die papain-artigen und hier die Metalloproteasen.
Wir stoßen immer wieder auf dieses Prinzip – eine bereits ausgebildete sterische Komplementarität, keine Strukturveränderung.
Das Ausmaß, in dem der Inhibitor das Substrat imitiert, sich wie das Substrat bindet, variiert allerdings.
Hier haben wir den Fall der Serinprotease.
Bei der Cysteinprotease ist nur ein Teil der Substratbindungsstelle von einem Inhibitorsegment belegt.
Bei den Metalloproteasen finden sehr umfängliche, so genannte exozytäre Wechselwirkungen statt.
Die Inhibitoren – TIMP – sind wesentlich größer als die Protease, die sie inhibieren,
sie hüllen sie, wenn man so will, beinahe ein.
Daher sind für eine starke und spezifische Wechselwirkung beträchtliche exozytäre Interaktionen notwendig.
Die Überraschung kam in den 80er Jahren, als wir uns mit den Inhibitoren der Serinproteasen in unserem Blut beschäftigten,
die z.B. vor unerwünschter Gerinnung und vielen anderen Prozessen schützen.
Es handelt sich dabei um sehr große Serinproteinase-Inhibitoren, die die unterschiedlichste Form aufweisen.
Sie können in aktiver Form mit komplementärer Bindungsoberfläche,
d.h. komplementär zu der Substratbindungsstelle der Protease, oder in latenter Form, d.h. als Isomer auftreten.
Chemisch vollkommen identisch ist die Schleifenstruktur hier jedoch teilweise in das Beta-Faltblatt eingefügt.
Sie liegen in gespaltener Form vor, d.h. nachdem sie ihre Arbeit erledigt haben, werden sie von der Protease gespalten
und ordnen sich in einer Weise neu an, dass sich dieses rote Segment in das Beta-Faltblatt einfügt und die Komplexform entsteht.
Die Protease interagiert zunächst hier oben, spaltet dann die empfängliche Peptidbindung des Inhibitors
und ordnet sich auf der anderen Seite neu an.
Das Schema ist noch sehr viel komplexer, doch die anfängliche Bindung wird mit einer sterisch komplementären Form,
wie wir sie zuvor bei den kleinen Inhibitoren kennengelernt haben, eingegangen.
Das hier überspringe ich und komme zur nächsten Regulationsmöglichkeit, nämlich der Tatsache,
dass es Proteasen gibt, die absolut spezifisch sind.
Eine davon ist Thrombin selbst.
Erreicht wird diese Spezifität durch eine relativ komplizierte und ausgedehnte Substratbindungsoberfläche.
Das hier ist Thrombin mit einem eingeschobenen kleinen Inhibitor;
Sie sehen hier diese tiefe Schlucht, die die Substratbindungsstelle markiert.
Sie können sich vorstellen, dass hier nur eine sehr spezifische Aminosäuresequenz akzeptiert wird.
Dies wurde im Laufe der Evolution von blutsaugenden Tieren entdeckt und genutzt.
Diese Tiere leben von flüssigem Blut; wenn es gerinnt, sterben sie.
Die Entwicklung eines effizienten Systems zur Gerinnungshemmung stellt also einen großen evolutionären Vorteil dar.
Die Tiere verfügen in der Tat über äußerst spezifische und leistungsfähige Thrombin-Inhibitoren.
Wir befassten uns mit den verschiedenen, hier blau dargestellten Thrombin-Komplexen
und den unterschiedlichen wirksamen Thrombin-Inhibitoren in Blutegeln, blutsaugenden Insekten und Zecken.
Diese grünen, braunen oder violetten Moleküle passen perfekt in die Substratbindungsstelle,
die wir zuvor gesehen haben, benutzen jedoch ganz unterschiedliche Gerüste.
Die Natur spielt also herum und sorgt für Perfektion.
Spezifität lässt sich aber auch anders erzeugen.
Es gibt beispielsweise eine fast ausschließlich elektrostatische Komplementarität, die wir in den Proproteinkonvertasen finden.
Die wichtigste Proproteinkonvertase bei Säugetieren heißt Furin.
Es handelt sich dabei um ein Enzym, das notwendig ist, um Hormone, Zelloberflächenrezeptoren
und andere Proteine durch Spaltung an der polybasischen Spaltstelle zu aktivieren.
Auch dieser physiologische Prozess wird von Erregern zweckentfremdet.
Diese Erreger – es finden sich recht prominente Namen in der Liste der Bakterien und Viren –
sind auf die Wirkung von Furin angewiesen, damit sie virulent werden können.
Sie brauchen die proteolytische Spaltung ihrer Hüllproteine, um beispielsweise das Toxin Anthrax zu aktivieren.
Auch hier haben wir also eine polybasische Spaltstelle.
Wie Sie sich vorstellen können,
besteht seitens der Pharmaindustrie großes Interesse an der Entwicklung von Furin als therapeutischem Target.
Die Rückseite der Medaille ist jedoch die enorme physiologische Relevanz dieser ….
ich komme später noch einmal darauf zurück.
Wie wird nun die Spezifität erreicht?
Das hier ist das Molekül, das Substrat bindet sich an dieser Stelle daran.
Die Spezifität wird erzielt, indem, was nicht überraschend ist, eine stark saure Bindungsstelle erzeugt wird.
Dort befinden sich zahlreiche Glutamate und Aspartate, die die Bindungsstelle für den Oligo-Lysin-Arginin-Inhibitor bilden.
Das heißt Spezifität hauptsächlich durch Elektrostatik.
Das war die bisher einzige Publikation, mit der wir in die Bildzeitung gekommen sind, weil sie eben von solcher Bedeutung ist.
Doch nun zur Proenzymspaltung.
Die meisten Proteasen werden als Proenzyme synthetisiert, und es gibt zwei Wege sie zu aktivieren.
In beiden Fällen findet eine begrenzte Proteolyse statt.
Einmal wird ein Teil weggeklappt – bei diesem Prozess kann sich die Konformation verändern, muss es aber nicht.
Hier haben wir keine Konformationsveränderung, hier haben wir eine, hier sind Beispiele für beides.
Das einfachste Beispiel haben wir bei der Procarboxypeptidase gesehen.
Auch hier können wir die klassische Carboxypeptidase-Struktur mit der Procarboxypeptidase-Struktur vergleichen
und finden keine Strukturveränderung.
Das ist die aktive Stelle, markiert durch eine Vertiefung.
Der Pro-Teil klappt nach der begrenzten proteolytischen Spaltung weg und legt damit ganz einfach die Substratbindungsstelle frei.
Dies hier ist eine Variation desselben Schemas.
Es handelt sich um Kumamolysin, eine Protease aus einem stark thermophilen Bakterium.
Das ist der Enzym-Teil, das der Pro-Teil.
Es zeigt sich eine sehr ausgedehnte Bindungsregion, die der Substratbindungsstelle folgt, allerdings nicht genau.
Sie wird nicht oder erst nach einem Signal, wahrscheinlich einem Temperaturanstieg, gespalten,
um sich geringfügig neu anzuordnen, so dass die aktiven Stellen sie bearbeiten können.
Im Anschluss daran klappt der Pro-Teil weg und die Substratbindungsstelle liegt frei.
Bei Vergleich des aktiven Enzyms mit dem Proenzym kommt es auch hier nicht zu einer strukturellen Veränderung des Enzym-Teils.
Lassen Sie mich noch einmal zurückgehen.
Das ist die Proenzymspaltung und das ist das Serinprotein, Thrombin, Chymotrypsin.
Die biochemischen Grundlagen wurden bereits sehr früh von Hans Neurath und Earl Davie in Seattle untersucht.
Sie stellten fest, dass ein Zymogen an einer spezifischen Peptidstelle mit der Sequenz Arginin, Isoleucin
und dann diesem kurzen Peptid gespalten wird, der Pro-Teil wegklappt und das Enzym so aktiviert wird.
Das war der biochemische Nachweis.
Jetzt schauen wir uns die Strukturen an.
Das ist eine modernere Version mit Thrombin als Beispiel.
Doch was hier passiert, ist genau dasselbe wie bei der gesamten Familie der trypsin-artigen Serinproteasen.
Wir haben die inaktive Vorstufe mit der geschlossenen Schleife, eine spezifische Spaltung
und dann den Einschub dieses neuen N-Terminus hier in der Mitte des Moleküls
und damit eine beträchtliche Umgestaltung der Oberfläche.
Der Auslöser dieser Oberflächenumgestaltung ist die Bildung einer Art internen Bindung.
Wie ich bereits sagte, ist dies der klassische Trypsinaktivierungsmechanismus.
Ich werde später in einem anderen Kontext noch mal einmal darauf zurückkommen.
Eine andere Möglichkeit zur Regulierung oder Begrenzung der proteolytischen Wirkung ist die Kolokalisierung.
Diese findet sich z.B. in sämtlichen Blutgerinnungsfaktoren der Gerinnungskaskade.
Die Strukturen sehen wie diese hier aus – das ist Faktor 10, einer der frühen Faktoren bei der Gerinnung.
Er besitzt einen Enzym-Teil, und von seiner Struktur her gehört er zu Trypsinfamilie.
Zudem weist er Linker-Domänen und einen Membrananker auf.
Auf diese Weise wird die Reaktion zweidimensional auf die Gefäßoberfläche, wo das Geschehen stattfinden soll, begrenzt.
Eine weitere Regulationsmöglichkeit der Protease-Aktivität, die in zwei Versionen vorkommt, ist die Cofaktorbindung.
Es gibt Systeme, bei denen ein Cofaktor, ein kleines oder größeres Protein,
die Spezifität bzw. Aktivität eines Enzyms bezüglich seines Substrats grundlegend verändert.
Dies kann grundsätzlich auf zweierlei Art und Weise erfolgen:
Einmal offeriert die Cofaktorbindung einfach eine neue Interaktionsstelle mit dem Substrat,
so dass die Bindung stärker und wirksamer ist.
Das andere Mal bewirkt der Cofaktor eine allosterische Veränderung des Enzyms,
und nur diese Konformationsänderung kann sich an das Substrat binden.
Uns begegnen beide Varianten.
Die erste Variante ist ein wunderbares Beispiel für die Folgen der Membrananker von Gerinnungsenzymen.
Das hier ist Thrombin, das über die Gla-Domäne peripher an die Membran gebunden ist.
Hier ist das Protein C, eine der Regulierungskomponenten der Gerinnungskaskade.
Protein C beendet die Gerinnung, wenn es aktiviert wird.
Die Aktivierung erfolgt durch Thrombin.
Thrombin hat also in diesem Fall gerinnungshemmende Eigenschaften,
während wir es für gewöhnlich mit gerinnungsfördernden Eigenschaften verbinden.
Durch die Protein C-Aktivierung blockiert es jedoch die Gerinnung.
Was tut nun das Protein C, wenn es aktiviert wird?
Ganz einfach, es baut alle vorgeschalteten Gerinnungsfaktoren ab.
Protein C und Thrombin haben überhaupt nur dann etwas miteinander zu tun, wenn eine dritte Komponente hinzukommt,
die aus offensichtlichen Gründen als Thrombomodulin bezeichnet wird.
Hier haben wir wieder eine kristallographische Studie.
Nun, wir wissen, dass es diese drei Domänen des Mehrdomänen-Thrombomodulins sind,
die für die Entstehung eines wirksamen Thrombins, des Thrombomodulin-Komplexes, verantwortlich sind –
wirksam in dem Sinne, dass Protein C aktiviert werden kann.
Das hier ist der binäre Komplex aus Thrombin und den drei Thrombomodulin-Domänen.
Und das ist der ternäre Komplex aus Thrombin, Thrombomodulin und Protein C,
der sich exakt ausgerichtet an sein empfängliches Peptid bindet,
das zwecks Aktivierung gespalten werden und an der aktiven Stelle des Thrombins zu liegen kommen muss.
Was Sie hier sehen, ist, dass zwischen Thrombomodulin und Protein C eine sehr große Interaktionsfläche entsteht.
Nur wenn diese Fläche vorhanden ist, kann sich der binäre Komplex an das Protein C binden.
Ohne Thrombomodulin ist die Affinität von Protein C zu Thrombin für eine wirksame Bindung zu gering.
Da wir auch die Strukturen der einzelnen Komponenten kennen, können wir sagen, dass keine Konformationsänderung stattfindet.
Der Cofaktor vergrößert also lediglich die Interaktionsflächen.
Es gibt aber noch eine andere Möglichkeit.
Jetzt bin ich wieder bei den Serinproteasen und ihrer Aktivierung, die ich Ihnen bereits erläutert habe;
Auslöser sind hier eine Art interne Brücke sowie die Neuanordnung.
Es gibt Staphylokokken, die, wenn sie in den Blutkreislauf gelangen, ziemlich gefährlich, de facto sogar tödlich sein können.
Sie zweckentfremden diesen physiologischen Prozess und verfügen über einen Virulenzfaktor, die so genannte Staphylocoagulase,
die mit der inaktiven Vorform des Thrombins interagiert und sie in einer Weise aktiviert,
dass ihre Aktivität der von aktivem Thrombin entspricht,
ohne dass der unserer bisherigen Meinung nach obligatorische proteolytische Schritt, den ich Ihnen zuvor gezeigt habe, erfolgt.
Das sind die Staphylocoagulase und ein alpha-helikales Protein; sie umschließt das Prothrombin.
Sie weist einen N-Terminus mit genau derselben Sequenz, wie wir sie beim aktiven Thrombin finden, auf
und heftet sich exakt dort an die Bindungsstelle, wo sich das inaktive Thrombin, der N-Terminus befindet.
Die Staphylocoagulase ist also ein Cofaktor,
der durch Simulation des physiologischen Aktivierungsmechanismus eine Konformationsänderung bewirkt
und in diesem Fall das Prothrombin aktiviert.
In diesem Beispiel kann das Substrat selbst als Aktivator fungieren.
Hierbei handelt es sich um kürzlich von uns durchgeführte Untersuchungen zu Tryptase,
ebenfalls einem sehr interessanten therapeutischen Target für bestimmte Lungenerkrankungen.
Sie verfügt über trypsin-artige Untereinheiten, bildet aber ein Tetramer, und die aktiven Stellen befinden sich hier drinnen.
Durch die Tetramerisierung wird der Zugang zu der Substratbindungsstelle beschränkt.
Dieses Prinzip findet sich auch beim Proteasom; ich werde ich einer Minute darauf zurückkommen.
Tryptase tritt physiologisch in zwei Formen auf.
Als Beta-Tryptase, dann ist sie aktiv.
Hier sehen Sie übrigens die Reste an der aktiven Stelle, Serin, Histidin und Aspartat,
und das hier ist die Andockstelle des Substrats.
Hierhin muss sich das Substrat ausrichten, damit es bezüglich Serin-Histidin wirksam positioniert ist.
Die andere Form ist die inaktive Alpha-Tryptase.
Sie ist sehr, sehr ähnlich.
Zwar stimmen die Sequenzen zu mehr als 90% überein, doch eine Sequenzänderung ist auffallend, nämlich…