Robert Huber

Proteasome and DegP Protease, Mechanisms and Drug Design

Category: Lectures

Date: 30 June 2011

Duration: 35 min

Quality: MD SD

Subtitles: EN DE

Robert Huber (2011) - Proteasome and DegP Protease, Mechanisms and Drug Design

Within cells or subcellular compartments misfolded and/or short-lived regulatory proteins are degraded by protease machines, cage-forming multi-subunit assemblages, the proteasome and HtrA/DegP

Good morning. It is a pleasure and a privilege to speak after Eddie Fischer as somebody and a colleague. He gives us hope that there are maybe many years of productive and joyful life ahead of us, so thank you Eddie for being here. Well, I speak about the life and death of proteins, this is the life cycle of proteins, protein synthesis, protein folding and protein degradation. In these processes enzymes, catalysts are involved, we heard about the big protein synthesis machine, the ribosome by Ada Yonath and Tom Steitz today. This is the high-resolution crystallography, this is an electro-micrograph showing ribosomes walking along the message and synthesising product protein. This is a model, I show this because there is a funny relationship to a Volkswagen car factory, so the conveyor belt being the message, this is the product, and these workers are the ribosomes. They have to move substantially, and we heard from both Yonath’s and Steitz’s talks there is substantial motion in the ribosome. Now protein folding is mostly spontaneous, but some proteins need help. And we see some of these helpers or chaperones, they are not as conserved as the ribosome in all kingdoms of life, but we see some conservation. This, for instance, is the bacterial GroEL/S chaperonin, as which is a big container enclosing the substrate proteins so that it has time to fold inside here. This is the archaeal and eukaryotic chaperonin that we analysed some years ago. So this is the American version, bullet shaped, and this is the somewhat more peaceful football, the German version. So different architectures, but they have in common subunits that are clearly related. Now, the situation with proteolytical enzymes is entirely different. This is by far the most diverse class of proteins that we find in nature. Now, proteases may be extremely dangerous if left uncontrolled, so a corollary to the diversity of proteolytic enzymes we see in the regulation. This brings me back to one of my first structural studies in the late ‘60s, early ‘70s on the basic pancreatic Trypsin inhibitor and Trypsin that you see here in complex. So this is the most simple case of protease regulation by a lock and key fitting of the inhibitor to the enzyme. So there is a perfect fit, these structures are perfectly complementary, no structural rearrangement. This is the secret behind the very tight interaction. Now, why did I pick in the late ‘60s BPTI? There’s a very simple reason, I had contact with the Bayer pharma company, and they made this material in gram and kilogram quantities up to now. And it was easily crystallised by simply pouring the protein solution into a concentrated ammonia, showing the enormous stability of this little molecule, which was, by the way, later the reason why BPTI became the model protein for the development of protein NMR, the work of Kurt Wüthrich in Zurich, with whom we collaborated for a while. Well, then, with 40 years more structural studies on protease regulation, we found a plethora of different mechanisms, so this is the simple one I just showed. We do have proteases which are extremely specific by having a very complex substrate binding surface. We do have regulation by having proenzymes which upon limited proteolyses come active. This may involve no or some allosteric structure change. We do have membrane anchored proteases which limit their activity to the two-dimensional surface of a vessel for instance, all the clotting enzymes of that kind do that cofactor binding. So this blue cofactor changes the specificity of an enzyme profoundly, particularly illustrating, nicely illustrating example is thrombin, which is known as declotting enzyme. But in the presence of thrombo-modelling it becomes an anti-coagulant. So we do understand this in molecular detail by structural studies. Now, what I would like to do this morning is to speak on these large intracellular protease systems, which are regulated by opening and closing the substrate by making available the substrate to approach the active site, which is buried inside the container. Well, the structure that we looked at in the last 15 years or so were these four huge intracellular proteases. I pick the proteasome and the stake PhtrA system for a closer look at it. Now, the proteasome, we heard in Hershko’s and Ciechanover’s lectures, these are central enzyme, central in-the-cell-cycles, because it degrades the signalling molecules. It also is central in the immune response, it makes the MHC Class I peptides, which trigger the t-cell immune response. It is central in the stress response of cell differentiation. Now, this is a somewhat different view on this system relating to the ubiquitin-conjugation system, about which you heard. Now, the polyubiquitinated proteins are recognised by the proteosome and degraded, so the cell cycle is signalling molecules. The proteasome is the base cleaner in cells, so it recognises denatured proteins as being useless and removes them, and it makes octapeptides out of them, which, when they come from foreign organisms, from viruses or bacteria, they trigger the t-cell response, as I already mentioned, so a very central molecule. Now, this is it, the first eukaryotic proteasome we analysed about 15 years ago. It consists of 28 subunits which are pseudo seven-fold symmetric. A heritage from its predecessor, which is the archaeal enzyme, which is exactly seven-fold symmetric but has the same architecture. There are the alpha rings, the beta rings, and the activity resides with the beta subunits and they are located inside. We also note already that the parting is closed, so it occurs in a late inform and I come back to that later. So the structure that we know of is that of the core particle, the proteolytic core, which is kept by the regulatory particle which is equally complex. We have little structural information, diffuse electromicrographs of this huge complex, but we know some of the functions it carries out, for instance the recognition of the polyubiquitin cleavage, recycling, unfolding and then feeding it into the proteolytic core. So of course we would like to know more about the details of these structures, and sooner or later it will come, it’s a crystallisation problem. Now, the catalytic site of the proteasome is an N-terminal threonine protease, as we found with the first structure we determined years ago, inhibitor binding. Now, of these 14 potentially active subunits of the beta type, only six of them are actually active. While the archaeal enzyme, which we first analysed, where all the betas are identical, all of them are active. So evolution then inactivated active sites, but it gained regulatory properties, an interesting and not uncommon aspect that we see in biology. Now, another quite fascinating aspect is that under an immune stimulus that is stimulated by gamma interferon, these active subunits are replaced by immune subunits, which are very, very similar. But there is specific changes which modulates the specificity. Now, the immune proteasome makes more MHC class I antigens. This is exactly what we would like to have. Now, we do have from modelling studies some idea of how this comes about, this shift in specificity, and there is quite active research going on, on finding inhibitors specific of the immune proteasome for transplantation, at medicine. One would like to have proteasome inhibitors that prevent rejection of transplants, so modulate the immune response against transplants without affecting the constitutive proteasome. Now, this is under way by mainly research groups. Well, I now come to the drug design aspect of the proteasome, which was spurred very much by the discovery of an American company, of Bortezomib, as a cancer drug target. Now, the problem with Bortezomib is its very serious toxic side effects. So Bortezomib is by no means the end, it’s a beginning. It’s a beginning because, as I said, it stimulated an intense search for other proteasome inhibitors. In most of these studies we were involved, because people sent us their products, which we studied crystalographically. So a major finding was that the natural compound libraries were very rich in proteasome inhibitors, and they have fantastic chemistries. So, what you see in yellow here, is a natural compound. This is an aldehyde group, this is an unsaturated amide, this is a beta-lactone, as well as these, this is a beta-epoxyketone, and this is a cross-linked peptide. Now, all of these from natural compound libraries which we looked at in their structure, to find out the reason for their tight binding and to show a way to chemically synthesise them, even if they have simplified versions. Well, another quite important finding was that the proteasome is a target for new antibiotics, and there were quite fascinating findings of inhibitors of the proteasome selective for microbacteria, so a new avenue of antibiotic design, which is also intensively pursued. Just a few glimpses of what we do by our structural studies: This was one of the first natural proteasome inhibitors, a beta-lactone, and it does what lactones do, they react with the N-terminal threonin and oscillate it. Now, this is a variant called salinosporamide A, which is very far advanced already in clinical development. Again a beta-lactone, but it has a chloroethyl group. Now, what happens, as the structure shows, is, once the hydroxcyl group becomes free after oscillation, then the chloroethyl group forms a ring and forms a tetrahydrofuran ring and makes it absolutely irreversible. Now, here you see again a beta-lactone with a long side chain and very surprisingly, unexpectedly the lactone oscillates, but the side chain points out in the opposite direction. This goes on and on, which I have no time to do, this is a natural compound epoxamicin, a beta-epoxiketone which reacts with the N-terminal threonin to form a morpholino ring, absolutely irreversible. Now, we designed a ketoaldehyde, which also forms a ring with the N-terminal threonin, but this is an oxazine ring which is hydrolytically susceptible. So we can in this way make inhibitors that are reversible and irreversible and check their physiological value. Well, I think I have to continue and perhaps come to this, a system which offered us a new chemical entity for proteasome inhibition. It was a discovery of our colleague Robert Dudler at the University of Zurich, a plant biologist who found that this plant pathogen, which kills bean plants, does so, well, needs a virulence factor which is the syringolin. Now, we found that this syringolin inhibits the plant proteasome, and if you look at the plant cells and you find that in the presence of this pathogen there’s an accumulation of polyubiquitinated cycling. So this leads to apoctosis and finally the killing of the bean plant. So we do understand how this pathogen works and its virulence factor acts on the proteasome. A further interesting aspect of this research was the finding that a human pathogen, Burkholderia, which also belongs to the Pseudomonas genus, causing an endemic disease in South Asian countries, melioidosis, also secretes a molecule which is very similar in its chemistry to syringolin and inhibits the proteasome. This is the structure of the proteasome complex, it binds very tightly, mainly via its additional hydraphobic tail, the syringolin has not. Again a new chemical entity for further development, because it can be and has been synthesised. Well, this proteasome inhibitor development leads beyond of what an academic group can do. So a company that I helped to found about twelve years ago, now joined up with the Technology Transfer unit of the Max Planck society to develop that further. What they did over the years was to make use of all the structural information which you find superimposed here, and to combine the components that we see in these various complexes in different ways as a lead to new molecules. Well, a few words about evolution of the proteasome, so the structure that I mainly showed to you was the eukaryotic proteasome, exemplified by the years but very similar to human and bovine. And the first structure that we had analysed was the archaeal one. The same architecture, I mentioned already, but here all the alphas and the betas are different here, and the eukaryotes are identical. Bacteria usually do not have a proteasome, but they have a somewhat related protease, which is called HslV. Now, it’s related already at the sequence level, and then, as we found on the structural level, the point I wanted to make here is the following: So we have this bacterial HslV related to the beta-subunits of the archaeal proteasome, this is the archaeal proteasome, where all these subunits are identical in the alphas and in the betas. And then, suddenly, in eukaryotes all these subunits are different. So this is a revolutionary step which we still do not understand. What we now know, is that in the modern eukaryotic proteasome none of the subunits can replace another one. But there must have been in evolution existed proteasomes which are mixed. Well, then I come to the recent DegP system, and the normal mode of regulation of proteolytic activity that we found here. A huge protein family, ubiquitously found in higher and lower organisms. They have a common construction scheme, there is a protease core which is trypsin-like, associated with PDZ domains. Now, these PDZ domains are peptide binding domains, C-terminal peptide binding domains, which have been found in many other protein systems. There are some variations and applications, not so important. Well now what is the Deg and the htrA? now, Deg stands for degradation. P for Periplasma, htrA stands for High Temperature Requirement. And in fact the finding, the discovery of this class was that of a protease and of a chaperone, and I come back to that later. Now, we find an important role of the Degs in plant chloroplasts. They are there to screen and to degrade and remove a central component of the reaction centre of photosystemII, mainly the subunit D1. Now what is the subunit D1? Now, I take the opportunity to go back to the work on the photosynthetic reaction centre, which you see here, which has L and M subunits, and you will see in the next slide that the L subunit is the homolog of the plant D1. Now, the unexpected finding of the function, and then explained by the structure of the photosynthetic reaction centre that only one branch, the L branch, of this nearly symmetrical system is active in electron transfer. Now, electron transfer in organic material is definitely stressful. This is a much later work by some groups in the crystal structure analysis of photosystemII, in which I compared here with the L and M, and the comparison shows that L and M and D1 and D2 are very closely similar. So L corresponds to D1. Now, here in the plant photosystem, you have in addition to the photo-induced electron transfer, also the water splitting, the oxygen evolving complex, which is also associated with D1, so D1 is in a very stressful situation, both by the electron transfer it carries out and by the water splitting reaction, so no surprise that D1 is easily and quickly damaged, and it has to be removed and for that removal we have the Degs implant chloroplast. Well, I have to show that. The work on the bacterial photosynthetic reaction centre led to a Nobel prize in 1988. Now, look at these three people and look at this guy. So a Nobel prize does not make happy, I would say. Well, the htrs in human cells are much more complex, but again involved in many processes, of particular interest is its involvement in the processing of the APP, so htrA is a focus of drug design and further research. And I now come back to the bacterial, the rolling bacteria of the Degs and htrAs in the unfolded protein response. Now, the Degs are there to screen the periplasmic space for misfolded proteins and in particular for misfolded outer membrane proteins. Now, these outer membrane proteins have in fact a rather difficult life. They are made in the cytosol, transported through such plasma membrane, they have to transit the periplasmic space and then be incorporated in the outer membrane. So difficult reactions and the danger of being misfolded. And a non-functional outer membrane protein, they are recognised and processed by the DegP system, that I’ll tell you in the following few slides how that works. Well, this is an outer membrane protein, it’s a trimer of beta-barrels, it sits in the outer membrane and it has a c-terminus that is part of the barrel. And you will see in a minute that this is the signal for folded- or unfoldedness. If this is available sticking out in solution, then this is recognised as unfolded, if it is incorporated in the structure, then it is regarded as perfectly folded and functional. The first structure that we had some years ago was that of an inactive DegP, and we arelady saw two forms, so it’s a snap shot of two forms of the same molecule, showing the green trypsin trimer, which is very much trypsin-like, and the PDZ domains, but the arrangement of the PDZ domains is different in these two confirmers. So this makes a close confirmer, this is an open confirmer. So clearly we can produce a movie showing this excessive mobility of the PDZ domains and the relative stability of the trimeric trypsin. Now, this hexameric state is inactive. And it’s inactive, easily explained, because the substrate binding site here is completely distorted. Now, here we have a superposition of the green inactive DegP6 with an active trypsin, this segment is the substrate binding site, the substrate just aligns here, this is completely destorted, easily explained inactivity. Now, the key observation some years ago was a very simple one - we just had to have open eyes - was this HPLC chromatography. So you take DegP6, which is inactive, mix it with Casein, which is a lay-by, an easily degradable protein, and make after one minute, so immediately after mixing, an HPLC run. Then you see Casein, you do not see any DegP6, but instead you see a DegP24. Now you wait half an hour, all the Casein has gone, the 24-mer of DegP has gone and the hexamer is back. So this was the key for all the further work, the key experiment that I now would like to briefly describe. First we had to find out what is the trigger for this conversion, and it was found it’s a simple peptide, just tripeptide of the c-terminals of an outer membrane protein. Then we determined the structure of this bound, tripeptide not to DegP but to DegS, which is a close homologue found and it binds to the PDZ domain, and it causes a structural change of the neighbouring protease domain, which is inactive, as I said, in the hexameric form, becomes active by a push and pull mechanism triggered by the peptide bounded PDZ domain. Next step was then the cristallography of this 24-mer, a huge cage in which actually an OMP sits in the crystal. We do not see it because it’s rotationally disordered, we just see the walls, which are very well ordered. This 24-mer has the symmetry of a cube, eight corners and on each of these corners a trimer of trypsin sits with its PDZ domains. A beautifully symmetrical structure that we see here. By electromicroscopy also a 12-mer was analysed, now, this is a tetrahedron, and on each of the four corners sits a trimer of trypsins and then the rearranged PDZ domains. Now, by EM we do see the bound inside the particle. Well, as I said, the DegP6 is inactive because of the distorted substrate bindings site, in the active 24-mer these loops have rearranged and the substrate bindings site is accessible and the enzyme becomes active. Well, I already told you that the Deg serve as chaperones as well. Now, what is the switch between the chaperone and the protease function? What happens is we do have an unfolded or partly folded OMP, which interacts with the inactive DegP and then triggers the formation of the spherical shell. So OMP sits inside a shell consisting of 24 hungry proteases, does it have any chance? It has a chance if it is able to withdraw its c-terminus, which, as I told you, is the trigger for the formation of the shell, incorporated into its own body, and then the shell dissolves and the healthy OMP then can be integrated into the outer membrane and do its job there. So it’s, I think, the degree of unfoldedness which determines whether there is protolytic activity or chaperone activity in this system. This is for the young guys but I can discuss that in my meeting with the students this afternoon, telling them that structural biology is not only a big fun and interesting results, but it is also a basis for finding a job in this field. With this I would like to thank you and tell you that Munich is close by train or by car and you should have a look at it. Thank you.

Guten Morgen. Es ist ein Vergnügen und ein Privileg als Kollege, der ein gutes Stück jünger ist, einen Vortrag im Anschluss an Eddie Fischer zu halten. Er gibt uns die Hoffnung, dass vielleicht noch viele Jahre eines produktiven und frohen Lebens vor uns liegen. Danke also, Eddie, dass du hier bist. Nun, ich spreche über das Leben und den Tod von Proteinen, dies ist der Lebenszyklus von Proteinen: Proteinsynthese, Proteinfaltung und Proteinabbau. An diesen Prozessen sind Enzyme, Katalysatoren beteiligt. Von Ada Yonath und Tom Steitz haben wir heute einiges über die große Proteinsynthesemaschine, das Ribosom, erfahren. Dies ist die hochauflösende Kristallographie und dies eine elektronenmikroskopische Aufnahme, die zeigt, wie ein Ribosom die Informationen zur Synthese eines Proteins abliest und es als Produkt dieser Synthese herstellt. Dies ist ein Modell. Ich zeige es, weil eine lustige Beziehung zu einem PKW-Montagebetrieb von Volkswagen besteht, wobei das Fließband die Informationen zur Synthese darstellt, dies das Produkt, und diese Arbeiter sind die Ribosomen. Sie müssen sehr fleißig sein, und wir haben in Yonaths und Steitz’ Vorträgen erfahren, dass es auch im Ribosom zu intensiver Aktivität kommt. Die Faltung der Proteine geschieht größtenteils spontan, einige Proteine benötigen jedoch Hilfe. Und wir sehen hier einige dieser Helfer oder „Chaperone“. Sie sind nicht in allen Bereichen des Lebens auf gleiche Weise erhalten geblieben wie die Ribosomen, doch zumindest in einigen. Dies ist beispielsweise das bakterielle GroEL/S-Chaperonin. Es handelt sich dabei um einen großen Behälter, der das Substratprotein umschließt, sodass es Zeit hat, sich darin zu falten. Dies ist das Chaperonin der Urbakterien und der Eukaryoten, das wir vor einigen Jahren analysiert haben. Dies hier ist die amerikanische Version, die aussieht wie eine Gewehrkugel, und dies ist der etwas friedlichere Fußball, die deutsche Version. Es handelt sich also um unterschiedliche Architekturen, doch sie haben Untereinheiten gemeinsam, die offensichtlich miteinander verwandt sind. Nun, die Situation bei proteolytischen Enzymen ist eine völlig andere. Es ist die bei Weitem vielfältigste Klasse von Proteinen, die wir in der Natur finden. Proteasen können äußerst gefährlich sein, wenn ihre Funktion nicht gesteuert wird. Daher sehen wir in der Regulierung eine Begleiterscheinung zur Vielfalt der proteolytischen Enzyme. Dies bringt mich zurück zu einer meiner ersten strukturellen Untersuchungen in den späten 1960er bzw. frühen 1970er Jahren über den grundlegenden Trypsininhibitor der Bauchspeicheldrüse und über Trypsin, das Sie hier in diesem Komplex sehen. Dies ist der einfachste Fall der Steuerung einer Protease: dadurch, dass der Hemmstoff in das Enzym passt wie ein Schlüssel in ein Schloss. Es handelt sich hierbei um eine perfekte Passung. Diese Strukturen sind völlig komplementär, und es kommt zu keiner strukturellen Neuanordnung. Dies ist das Geheimnis hinter der sehr engen Wechselwirkung. Nun, warum habe ich mir in den späten 1960er Jahren BPTI ausgesucht? Hierfür gibt es einen sehr einfachen Grund: Ich stand mit dem Pharmaunternehmen Bayer in Kontakt, und sie stellten dieses Material bis dahin in Mengen von Gramm und Kilogramm her. Es ließ sich sehr leicht kristallisieren, indem man einfach die Proteinlösung in konzentriertes Amoniak goss. Dies zeigte die enorme Stabilität dieses kleinen Moleküls, was – nebenbei bemerkt – später der Grund dafür war, warum BPTI das Musterprotein für die Entwicklung der Kernspinresonanz-Untersuchung der Proteine wurde, der sich die Arbeiten von Kurt Wütherich in Zürich, mit dem ich eine Zeit lang zusammengearbeitet habe, widmeten. Nun ja, in 40 Jahren weiterer Forschung über die Proteaseregulation fanden wir eine Vielzahl verschiedener Mechanismen. Dies ist der einfache Mechanismus, den ich gerade gezeigt habe. Es gibt Proteasen, die äußerst spezifisch sind, da sie eine sehr komplexe Bindungsoberfläche für das Substrat haben. Es gibt Regulationen, an denen Proenzyme beteiligt sind, die nur bei einer begrenzten Zahl von Proteolysen aktiv werden. Hierbei können allosterische Strukturänderungen eine Rolle spielen oder nicht. Es gibt auch an Membranen verankerte Proteasen, die ihre Aktivität beispielsweise auf die zweidimensionale Oberfläche eines Gefäßes beschränken. Eine solche Kofaktorenbindung findet sich bei sämtlichen Gerinnungsenzymen dieser Art. Dieser Kofaktor ändert also die Spezifität eines Enzyms grundlegend. Ein besonders anschauliches Beispiel ist Thrombin, welches als Enzym bekannt ist, das im Gerinnungsprozess des Blutes eine wichtige Rolle spielt. Wenn ein Thrombus simuliert wird, wird es jedoch zu einem Antikoagulantium. Strukturuntersuchungen haben dies bis in molekulare Details aufgeklärt. Was ich heute morgen tun möchte, ist Folgendes: Ich möchte über diese großen intrazellulären Proteasesysteme sprechen, die dadurch reguliert werden, dass das Enzym geöffnet oder geschlossen wird, sodass dem Substrat das aktive Zentrum zugänglich wird, das sich im Inneren des Behälters befindet. Die Strukturen, die wir nun seit etwa 15 Jahren untersucht haben, waren diese vier riesigen intrazellulären Proteasen. Für eine detailliertere Betrachtung wähle ich das Proteasom- und das DegP/HtrA-System aus. Das Proteasom-System ist – wir haben davon in den Vorträgen von Hershko und Ciechanover gehört – ein zentrales Enzym. Es spielt eine zentrale Rolle im Zellzyklus, weil es die Signalmoleküle abbaut. Es ist ferner von zentraler Bedeutung für die Immunreaktion. Es stellt die MHC-Peptide der Klasse I her, die der Auslöser der Immunreaktion der T-Zellen sind. Es ist zentral für die Stressreaktion der Zelldifferenzierung. Nun, dies ist eine etwas andere Sicht auf dieses System, die mit dem Ubiquitin-Konjugationssystem zu tun hat, von dem Sie bereits gehört haben. Die mehrfach mit Ubiquitin markierten Proteine werden vom Proteasom erkannt und abgebaut, also die Signalmoleküle des Zellzyklus. Das Proteasom erfüllt eine grundsätzliche Reinigungsfunktion in Zellen: Es erkennt denaturierte Proteine als nutzlos und entfernt sie. Es macht daraus Okta-Peptide, die – wenn sie aus fremden Organismen stammen, aus Viren oder Bakterien – die T-Zellen-Reaktion auslösen, wie ich bereits sagte. Es handelt sich demnach um ein Molekül von zentraler Bedeutung. Nun, dies ist es: das erste eukaryotische Proteasom, das wir vor 15 Jahren untersucht haben. Es besteht aus 28 Untereinheiten, die eine pseudo-siebenfach-Symmetrie aufweisen. Hierbei handelt es sich um das Erbe seines Vorläufers, ein Enzym der Urbakterien, das genau siebenfach symmetrisch ist, aber denselben Aufbau hat. Es besteht aus Alpha- und Beta-Ringen, wobei die Aktivität in den Beta-Untereinheiten im Inneren des Moleküls stattfindet. Wir erwähnten auch bereits, dass das Proteasom geschlossen ist, sodass es in einer latenten Form vorkommt. Ich werde später noch darauf eingehen. Die Struktur, die wir kennen, ist die des zentralen Teils, des proteolytischen Kerns, der vom regulierenden Teil, der ebenso komplex ist, umgeben ist. Wir haben nur wenig Informationen, diffuse elektronenmiskroskopische Aufnahmen, über die Struktur dieses riesigen Komplexes, doch wir kennen einige der Funktionen, die er übernimmt, wie zum Beispiel die Erkennung der Polyubiquitinspalte, die er recycelt, auffaltet und dann in den proteolytischen Kern weiterleitet. Natürlich wüssten wir gern mehr über die Einzelheiten dieser Strukturen, und früher oder später werden wir dieses Wissen erlangen. Es ist ein Kristallisationsproblem. Nun, das katalytische Zentrum des Proteasoms ist eine N-terminale Threoninprotease, wie wir bei der ersten von uns vor Jahren analysierten Struktur festgestellt haben, die mit einen Hemmstoff eine Verbindung eingeht. Von diesen 14 potentiell aktiven Untereinheiten vom Beta-Typ sind nur sechs tatsächlich aktiv, während bei dem Enzym der Urbakterien, das wir zuerst analysierten und bei dem alle Beta-Untereinheiten identisch waren, alle von ihnen aktiv waren. Die Evolution deaktivierte also aktive Zentren, doch sie führte zu regulatorischen Eigenschaften. Dies ist ein interessanter Aspekt, der uns in der Biologie nicht selten begegnet. Ein weiterer, recht faszinierender Gesichtspunkt ist, dass diese aktiven Untereinheiten während einer Immunstimulation, die durch Gamma-Interferon zustande kommt, durch Immununtereinheiten ersetzt werden, die sehr, sehr ähnlich sind. Doch es gibt spezielle Änderungen, die die Spezifität ändern. Das Immunproteasom erzeugt mehr MHC-Antigene der Klasse 1. Dies ist genau, was wir gerne hätten. Aus Modellstudien haben wir eine ungefähre Vorstellung davon, wie dies zustande kommt, diese Änderung der Spezifität, und in der Transplantationsmedizin wird aktiv nach Hemmstoffen geforscht, die für das Immunproteasom spezifisch sind. Man sucht nach Proteasominhibitoren, die die Abstoßung der transplantierten Organe verhindern, die die Immunantwort auf die Transplantate verändern, ohne das konstitutive Proteasom zu beeinflussen. Dies wird gegenwärtig von zahlreichen Forschungsgruppen untersucht. Ich komme nun zu demjenigen Aspekt des Proteasoms, der mit der Entwicklung von Arzneimitteln zu tun hat, der sehr stark von der Entdeckung von Bortezomib als Angriffsziel von Medikamenten zur Krebstherapie durch ein amerikanisches Unternehmen beflügelt wurde. Das Problem mit Bortezomib sind seine sehr starken, giftigen Nebenwirkungen. Bortezomib ist also alles andere als der Endpunkt, es ist ein Anfang. Es ist ein Anfang, wie ich sagte, weil es eine intensive Suche nach Proteasominhibitoren angeregt hat. An den meisten dieser Studien sind wir beteiligt, weil uns die Leute ihre Produkte schicken, die wir dann kristallographisch untersuchen. Ein wichtiges Ergebnis war, dass die Sammlungen natürlicher Verbindungen sehr viele Proteasominhibitoren enthalten, die über fantastische chemische Eigenschaften verfügen. Was Sie hier in Gelb sehen, ist eine natürliche Verbindung. Dies ist eine Aldehydgruppe, dies ist ein ungesättigtes Amid, dies ist ein Beta-Lakton, ebenso wie diese, dies ist ein Beta-Epoxyketon und dies ist ein quervernetztes Peptid. Sie stammen alle aus den Sammlungen natürlicher Verbindungen, deren Struktur wir untersucht haben, um den Grund zu finden, warum sie sich so eng binden, und um einen Weg aufzuzeigen, auf dem sie chemisch synthetisiert werden können, selbst wenn sie vereinfachte Versionen haben. Ein weiteres, recht wichtiges Resultat war, dass das Proteasom ein Angriffziel für neue Antibiotika darstellt. Es ist faszinierend, dass wir Inhibitoren gefunden haben, die selektiv auf die Proteasome von Mikrobakterien wirken. Dies eröffnet der Entwicklung von Antibiotika einen neuen Weg, der ebenfalls intensiv erforscht wird. Ich will Ihnen nun lediglich einen kleinen Einblick in das geben, was wir bei unseren Strukturuntersuchungen machen. Dies war einer der ersten natürlichen Proteasominhibitoren, ein Beta-Lakton. Es verhält sich wie ein Lakton: Es reagiert mit dem N-terminalen Threonin und acyliert es. Nun, dies ist eine Salinosporamid A genannte Variante, die sich bereits in einem fortgeschrittenen Stadium der klinischen Entwicklung befindet. Auch dies ist ein Beta-Lakton, allerdings mit einer Chloroäthylgruppe. Wie die Struktur zeigt, passiert Folgendes: Sobald die Hydroxylgruppe nach der Acylierung frei wird, bildet die Chloroäthylgruppe einen Ring und bildet dann einen Tetrahydrofuranring, den sie absolut irreversibel macht. Hier sehen Sie erneut ein Beta-Lakton mit einer langen Seitenkette, und überraschender-, unerwarteterweise acyliert das Lakton, doch die Seitenkette zeigt in die entgegengesetzte Richtung. Die Reihe dieser Stoffe ist lang, und ich habe nicht die Zeit, auf sie einzugehen. Dies ist die natürliche Verbindung Epoxomicin, ein Beta-Epoxi-Keton, das mit dem N-terminalen Threonin reagiert, um auf absolut irreversible Weise einen Morpholino-Ring zu bilden. Wir haben ein Ketoaldehyd entwickelt, das ebenfalls einen Ring mit dem N-terminalen Threonin bildet, doch dies ist ein Oxazinring, der für Hydrolyse anfällig ist. Auf diese Weise können wir Inhibitoren herstellen, die reversibel und die irreversibel sind und ihren physiologischen Wert überprüfen. Nun, ich glaube, ich muss fortfahren, und Ihnen nun vielleicht als nächstes Folgendes vorstellen: ein System, das uns ein neues chemisches Gebilde für die Proteasominhibition bietet. Es ist eine Entdeckung unseres Kollegen Robert Dudler an der Universität Zürich, eines Botanikers, der herausfand, dass dieses Pflanzenpathogen, das Bohnenpflanzen tötet, dazu einen Virulenzfaktor benötigt, bei dem es sich um Syringolin handelt. Nun, wir stellten fest, dass dieses Syringolin das Pflanzenproteasom hemmt, und wenn man sich die Pflanzenzellen anschaut, stellt man fest, dass es in Gegenwart dieses Pathogens zu einer Ansammlung von mehrfach mit Ubiquitin markiertem Cyklin kommt. Dies führt zum programmierten Zelltod (Apoptose) und schließlich zum Absterben der Bohnenpflanze. Wir verstehen, wie dieses Pathogen wirkt, und sein Virulenzfaktor beeinflusst das Proteasom. Ein weiterer interessanter Aspekt dieser Forschung war die Entdeckung, dass ein Krankheitserreger des Menschen, Burkholderia, der ebenfalls zur Gattung Pseudomonas gehört und eine in südasiatischen Ländern endemische Krankheit, die Melioidosis, verursacht, ebenfalls ein Molekül absondert, dessen Chemie der von Syringolin sehr ähnlich ist und das Proteasom hemmt. Dies ist die Struktur des Proteasomkomplexes. Seine Bestandteile sind sehr eng miteinander verbunden, hauptsächlich über seinen zusätzlichen hydrophoben Fortsatz, den Syringolin nicht besitzt. Auch hierbei handelt es sich um eine neue chemische Verbindung für weitere Entwicklungen, da sie synthetisiert werden kann und bereits synthetisiert worden ist. Nun, diese Proteasominhibitorentwicklung führt über das hinaus, was von einer akademischen Arbeitsgruppe geleistet werden kann. Daher hat sich ein Unternehmen, bei dessen Gründung ich vor 12 Jahren behilflich war, mit der Technologietransfereinheit der Max-Planck-Gesellschaft zusammengetan, um diese chemische Verbindung weiterzuentwickeln. Was sie im Laufe der Jahre getan haben, war Folgendes: Sie nutzten sämtliche Informationen über die Struktur, die hier als Überlagerung dargestellt ist, und kombinierten die Komponenten, die wir hier in diesen verschiedenen Komplexen sehen, auf verschiedene Weise als Leitfaden für die Erstellung neuer Moleküle. Nun möchte ich noch etwas über die Evolution des Proteasoms sagen. Die Struktur, die ich Ihnen hauptsächlich gezeigt habe, war das eukaryotische Proteasom, veranschaulicht durch die Hefe, doch dem Proteasom des Menschen und des Rindes sehr ähnlich. Und die erste Struktur, die wir analysierten war die der Urbakterien. Wie ich bereits erwähnte, handelt es sich um dieselbe Architektur, doch hier sind alle Alphas und Betas verschieden, und die der Eukaryoten sind identisch. Bakterien verfügen normalerweise über kein Proteasom, doch sie haben eine verwandte Protease, die als HslV bezeichnet wird. Sie ist bereits auf der Sequenzebene verwandt, und dann, wie wir auf der Strukturebene herausfanden, ist der Punkt, auf den ich hinweisen wollte, der folgende: Wir haben also hier dieses bakterielle HslV, das mit den Beta-Untereinheiten des Proteasoms der Urbakterien verwandt ist, dies ist das Proteasom der Urbakterien, bei dem alle diese Untereinheiten in den Alphas und den Betas identisch sind. Und dann sind bei den Eukaryoten plötzlich alle Untereinheiten verschieden. Dies ist ein revolutionärer Schritt, den wir noch immer nicht verstehen. Was wir heute wissen, ist jedoch, dass im modernen eukaryotischen Proteasom keine Untereinheit eine andere ersetzen kann. Doch es muss im Laufe der Evolution Proteasome mit „gemischten“ Untereinheiten gegeben haben. Nun komme ich zum modernen DegP-System und zur normalen Art der Regulation der proteolytischen Aktivität, die wir dort finden: zu einer großen Proteinfamilie, die in höheren und niedrigen Organismen überall zu finden ist. Die Proteine sind nach einem gemeinsamen Schema aufgebaut: Sie haben einen Protease-Kern, der Trypsin ähnlich und mit PDZ-Domänen assoziiert ist. Nun, diese PDZ-Domänen sind Peptide bindende Domänen, die man in vielen anderen Proteinsystemen gefunden hat. Es gibt einige Variationen und Anwendungen, was nicht so wichtig ist. Was haben wir unter Deg und HtrA zu verstehen? Nun, Deg steht für „Degradation“ (Abbau), P für „Periplasma“ und HtrA für „High Temperature Requirement“ (Hochtemperaturerfordernis) Das Auffinden, die Entdeckung, dieser Klasse bestand in der Entdeckung einer Protease und eines Chaperons. Ich werde später noch darauf zurückkommen. Nun, wir haben festgestellt, dass Degs in den Chloroplasten von Pflanzen eine wichtige Rolle spielen. Sie befinden sich dort, um eine zentrale Komponente des Reaktionszentrums von Photosystem II, in der Hauptsache die Untereinheit D1, zu selektieren, abzubauen und zu entfernen. Was ist nun die Untereinheit D1? Ich nehme diese Frage als Gelegenheit, um auf die Arbeit über das Reaktionszentrum der Photosynthese zurückzukommen, das Sie hier sehen. Es hat L- und M-Untereinheiten, und Sie werden auf dem nächsten Dia sehen, dass die L-Untereinheit das Homolog der Pflanzenuntereinheit D1 ist. Die unerwartete Entdeckung der Funktion von D1, die dann durch die Struktur des photosynthetischen Reaktionszentrums erklärt werden konnte, ergab, dass im Elektronentransfer nur ein Zweig dieses fast symmetrischen Systems aktiv ist, und zwar der L-Zweig. Nun stellt die Übertragung von Elektronen in organischem Material definitiv eine Belastung dar. Dies ist eine wesentlich spätere Arbeit einiger anderer Gruppen, über die Kristallstrukturanalyse von Photosystem II. Ich vergleiche Sie hier mit dem L und M, und der Vergleich zeigt, dass zwischen L und M und D1 und D2 eine sehr große Ähnlichkeit besteht. L korrespondiert also mit D1. Nun, hier im Photosystem der Pflanzen haben Sie zusätzlich zum lichtinduzierten Elektronentransfer die Aufspaltung von Wasser, den sauerstoffbildenden Komplex, der auch mit D1 assoziiert ist. D1 ist demnach in einer sehr belastenden Situation: sowohl durch den Elektronentransfer, den es durchführt, als auch durch die Wasserspaltungsreaktion. Es überrascht daher nicht, dass D1 sehr leicht und schnell beschädigt wird und dann entfernt werden muss. Und für diese Beseitigung sind die Degs im Chloroplasten der Pflanzen zuständig. Dieses Foto muss ich Ihnen einfach zeigen! Die Arbeit über das photosynthetische Reaktionszentrum der Bakterien führte zu einem Nobelpreis im Jahre 1988. Schauen Sie sich nun diese drei Leute und diesen Kerl an. Ich würde sagen, ein Nobelpreis macht nicht glücklich. Nun, die HtrAs in menschlichen Zellen sind wesentlich komplexer, doch ebenfalls an zahlreichen Prozessen beteiligt. Von besonderem Interesse ist ihre Rolle in der Verarbeitung von APP. Daher steht HtrA im Mittelpunkt der Medikamentenentwicklung und ist Gegenstand weiterer Forschung. Jetzt komme ich auch auf die Rolle der Degs und HtrAs in der Reaktion auf ungefaltete Proteine zurück. Die Degs haben die Funktion, den periplasmatischen Raum auf fehlgefaltete Proteine zu überprüfen, insbesondere auf fehlgefaltete Proteine der Außenmembran. Nun, diese Proteine der Außenmembran haben tatsächlich ein recht schwieriges Leben. Hergestellt werden sie im Cytosol und daraufhin durch solche Plasmamembranen transportiert. Sie müssen den periplasmatischen Raum durchqueren und dann in die Außenmembran eingebaut werden. Dies sind schwierige Reaktionen, und es besteht die Gefahr der fehlerhaften Faltung. Nichtfunktionale Proteine der Außenmembran werden als solche erkannt und durch das DegP-System verarbeitet. Wie genau das vor sich geht, erläutere ich Ihnen anhand der nächsten Dias. Dies ist ein Protein der Außenmembran. Es ist ein Primer von Beta-Fässern, sitzt in der äußeren Membran und verfügt über ein c-Ende, das Teil des Fasses ist. Sie werden gleich sehen, dass dies das Signal für das Gefaltet- oder Ungefaltetsein ist. Wenn dieses Ende vorhanden ist und in die Lösung hinausragt, wird das Protein als ungefaltet erkannt; ist es in die Struktur integriert, wird es als perfekt gefaltet und funktional angesehen. Die erste Struktur, über die wir vor einigen Jahren verfügten, war die eines inaktiven DegP, und wir sahen bereits zwei DegP-Formen. Es ist also ein Schnappschuss von zwei Formen desselben Moleküls, der den grünen Trypsin-Primer zu erkennen gibt, der Trypsin sehr ähnlich sieht, und der PDZ-Domänen, doch die Anordnung der PDZ-Domänen ist in diesen beiden Conformern unterschiedlich. Dies macht einen geschlossenen und dies einen offenen Conformer aus. Wir können diese übermäßige Beweglichkeit der PDZ-Domänen und die relative Stabilität des trimerischen Trypsin demnach in einem Film veranschaulichen. Dieser hexamere Zustand ist inaktiv, und seine Inaktivität ist leicht zu erklären, denn die Substratbindungstelle hier ist vollkommen verzerrt. Hier sehen wir eine Überlagerung des grünen, inaktiven DegP6 mit einem aktiven Trypsin. Dieses Segment ist die Substratbindungsstelle. Das Substrat richtet sich einfach hier aus. Dies ist völlig verzerrt, die Inaktivität daher leicht erklärt. Nun, die Schlüsselbeobachtung war vor einigen Jahren eine sehr einfache – wir brauchten nur offene Augen: Es war diese HPLC-Chromatographie. Man nimmt also DegP6, welches inaktiv ist, mischt es mit Casein, bei dem es sich um ein labiles, leicht abzubauendes Protein handelt, und führt nach einer Minute, also unmittelbar nach dem Mischen, eine HPLC-Untersuchung durch. Man sieht dann Casein, man sieht kein DegP6, doch stattdessen sieht man DegP24. Nun wartet man eine halbe Stunde, das gesamte Casein ist abgebaut, DegP24 ist verschwunden und stattdessen ist wieder der Hexamer (DegP6) vorhanden. Dies war der Schlüssel für alle weitere Arbeit, das Schlüsselexperiment, das ich jetzt kurz erläutern möchte. Zuerst mussten wir feststellen, welches der Auslöser für diese Umwandlung ist. Wir stellten fest, dass es ein einfaches Peptid ist, lediglich das Tripeptid des C-Terminals eines anderen Außenmembranproteins. Dann ermittelten wir die Struktur dieser Bindung, nicht des Tripeptids zu DegP, sondern zu DegS, bei dem es sich um ein von uns gefundenes, sehr nahe verwandtes Homolog handelt. Es bindet sich an die PDZ-Domäne und bewirkt eine strukturelle Veränderung der angrenzenden Proteasedomäne, die – wie ich bereits sagte – in der hexamerischen Form inaktiv ist. Aktiv wird sie durch einen Druck-und-Zug-Mechanismus, der durch die mit einem Peptid verbundene PDZ-Domäne ausgelöst wird. Der nächste Schritt bestand dann in der Kristallographie von DegP24, einem riesigen Gehäuse, in dem im Kristall ein OMP sitzt. Wir sehen dies nicht, weil es durch Drehung verzerrt ist, wir sehen lediglich die Wände, die sehr regelmäßig strukturiert sind. DegP24 hat die Symmetrie eines Würfels: acht Ecken. An jeder dieser Ecken sitzt ein Trimer von Trypsin mit seinen PDZ-Domänen, eine wunderschöne symmetrische Struktur, die wir hier sehen. Auch DegP12 haben wir elektronenmikroskopisch analysiert. Dies ist ein Tetrahedron, und an jeder der vier Ecken sitzt ein Trimer von Trypsin und dann die neuangeordneten PDZ-Domänen. Mithilfe des Elektronenmikroskops sehen wir die Bindung innerhalb des Partikels. Nun, wie ich bereits sagte: das DegP6 ist wegen der verzerrten Substratbindungsstelle inaktiv. Im aktiven DegP24 sind diese Schleifen neu angeordnet, die Substratbindungsstelle ist zugänglich und das Enzym wird aktiv. Ich habe Ihnen bereits gesagt, dass Degs auch als Chaperons fungieren. Worin besteht nun der Wechsel zwischen der Chaperon- und der Protease-Funktion? Was geschieht ist Folgendes: Wir haben ein ungefaltetes oder teilweise gefaltetes OMP, welches mit dem inaktiven DegP interagiert und dann die Bildung der runden Umhüllung auslöst. Das OMP sitzt also in einer Hülle, die aus 24 hungrigen Proteasen besteht. Hat es irgendeine Überlebenschance? Es hat eine Chance, wenn es ihm gelingt, seinen c-Fortsatz, der – wie ich Ihnen bereits sagte – der Auslöser für die Bildung der Hülle ist, einzuziehen und in seinen eigenen Körper zu integrieren. Daraufhin löst sich die Hülle auf und das intakte OMP kann in die Außenmembran eingebaut werden und dort seine Funktion erfüllen. Was darüber entscheidet, ob es zu einer proteolytischen oder zur Chaperonaktivität kommt, ist daher, denke ich, der Grad, bis zu dem ein Protein gefaltet ist. Dies ist eine Aufgabe für den Nachwuchs, doch ich kann das in meinem Treffen mit den Studenten heute Nachmittag diskutieren. Ich werde ihnen sagen, dass die strukturelle Biologie nicht nur einen riesigen Spaß macht und interessante Ergebnisse liefert, sondern dass sie auch die Grundlage für die erfolgreiche Suche nach einer Anstellung in diesem Arbeitsfeld ist. Hiermit möchte ich mich bei Ihnen bedanken und Ihnen sagen, dass München mit dem Zug oder PKW schnell zu erreichen ist, und dass sie die Stadt besuchen sollten. Ich danke Ihnen.

Abstract

Within cells or subcellular compartments misfolded and/or short-lived regulatory proteins are degraded by protease machines, cage-forming multi-subunit assemblages, the proteasome and HtrA/DegP. They are essential components in very complex regulatory pathways and interaction networks, the UPS (ubiquitin proteasome system) and the UPR (unfolded protein response), respectively. Their activity is precisely regulated by maturation from inactive precursors and sequestration of their proteolytic active sites within the particles (proteasome) and by activation of latent forms and oligomerization upon signaling by substrate (HtrA/DegP).
Both systems have proven (proteasome) or promise (HtrA/DegP) to be valuable targets for novel therapeutic drugs and antibiotics. The analyses of numerous crystal structures of the proteasome and the HtrA/DegP protein families complexed with ligands in conjunction with functional studies have provided a sound basis of structure-based design and development of many novel chemical entities as potential clinical candidates.
References:
Clausen, T., Kaiser, M., Huber, R. and Ehrmann, M. (2011). HTRA proteases: regulated proteolysis in protein quality control. Nature Reviews Molecular Cell Biology 12,152-162.
Gräwert, M. A., Gallastegui, N., Stein, M., Schmidt, B., Kloetzel, P. M., Huber, R. and Groll, M. (2011). Elucidation of the α-keto-aldehyde binding mechanism: A lead structure motif for proteasome inhibition. Angewandte Chemie Int. Ed. 50, 542-544.