Aaron Ciechanover

On the dynamics of our proteins: from basic mechanisms and onto the patient bed

Category: Lectures

Date: 5 July 2007

Duration: 39 min

Quality: SD

Subtitles: EN DE

Aaron Ciechanover (2007) - On the dynamics of our proteins: from basic mechanisms and onto the patient bed

Between the sixties and eighties, most life scientists focused their attention on studies of nucleic acids and the translation of the coded information. Protein degradation was a neglected area, considered to be a non-specific, dead-end process

I have the pleasure to introduce the next speaker, Professor Aaron Ciechanover from the Technion in Haifa, Israel. He received the Nobel Prize in chemistry together with Avram Hershko, who talked yesterday, and Irwin Rose for the discovery of ubiquitin-mediated protein degradation. Professor Ciechanover has been in Lindau every year since he got the prize and he obviously likes Lindau. And we want to thank him for his sympathy for the meeting and the support of the meeting. His lecture today is on the dynamics of our proteins from basic mechanisms to the patient bed. Aaron. I would join Richard Roberts' recommendation as for future projects or research of students. And by myself I would think, if I had to choose today, I would have walked into microbiology and virology, not only because it's fascinating, but because it's so awfully important. And if we think of just the past 30 years of legionella disease and ebola and avian flu and AIDS, we realise that we are living on a very thin margin. And some mutations in all those organisms would have caused them to be much more virulent and may have brought us back to middle ages and to black plague. And somehow we were under the illusion that we defeated infectious diseases. And, as Richard mentioned, governments stopped funding it and it was just an illusion. So let me start with my own talk, and I try not to overlap with my past mentor's talk yesterday, and I'll touch on the periphery of what he talked to you yesterday. I'll go a little bit to the history of the field of proteolysis in the ubiquitin system, not just to pay credit to the people that established the field, because I think that we play just, not a marginal role but we play the very defined role in the middle. But also to show you that once you are walking into the lab and you are up to a new project, you should really know what other people in the field have done. And you will see that always there are many milestones around and all that you have to do is just to combine threads and ropes and then, based on it, build new knowledge. And then I'll jump over the detailed history of the discovery itself and go directly to its application into medicine. And I'll show you how drugs are being developed, current drugs and also future drugs. Where the pharma companies are going with it. So we are all about proteolysis and proteolysis is an old process, we know it very well, that we have to hydrolyse amino acids. And it occurs in the body in different organelles and it's all about topology in the gastrointestinal track. It's a simple process, every protein that goes in is degraded non specifically. We remove antigenicity, we derive energy from nutrients and we know all about it. Once we are moving into that body, we are still in the circulation, extracellular, intracorporeal, they are very limited proteolytic system that are highly specific, one was mentioned yesterday by professor Robert Huber, the blood coagulation system, is a bona fide cascade of proteolytic events. But at the end fibrinogen is converted to fibrin and we are generating the blood clot, we know what happens in pathologies, overcoagulation, myocardial infarction, undercoagulation, a whole set of genetic diseases, haemophilias, but these are limited processes. Now we move into the cell and in the cell there are several proteolytic processes and when I was a graduate student, I joined Avram lab and we were interested in this process and it turns out that the process is extremely extensive. So what happens in our body is we are turning over our proteins, we are degrading them and resynthezise them in an amazing pace and the pace is, about 5 to 7% of our proteins are degraded daily and resynthetised, renewed, and the question is why it happens. And there are several reasons why it happens, one reason is obviously quality control. Many of our proteins get misfolded in nature because of many reasons. For example the high temperature that we are living, 37° is a deleterious temperature for proteins, high oxygen, 21%. Obviously there are many good evolutionary reasons why we are living at 37° and why we are living in an atmosphere of 21%. But on the other hand, this is deleterious to proteins and we have to exchange them. We control processes, you heard the lecture, the wonderful talk of Tim Hunt, Avram's yesterday. There are very good proteins, but we don't need the process anymore. Cell division, the cell, the entire cell cycle is controlled by a whole series of brakes and accelerators that have to be removed at certain time points, and that's another reason why to degrade proteins at a certain time point. And obviously, in order to keep the differentiated state and morphogenetic state of tissues, we need to remove certain proteins permanently at certain times, a process that is being reversed in malignancies. Now, let's go a little bit to the history. And in my opinion the founding father is Rudolf Schönheimer, a German Jew that went to the United States upon the rise of the Nazis to power, and he worked at the Rockefeller University in New York. And he, along with Harold Urey, used a very simple method, he used labelled amino acid, fed it into rats and found that the amino acid goes into proteins and then comes out. So he concluded that proteins or body constituents are in a dynamic state and he published a small monograph called on the dynamic state of body constituent. And this was published in 1942 at Harvard University press. And Rudolf Schönheimer died untimely, this is the obituary taken from the New York Times in '42 and it's clear that that's what he did and it says that his work helped establish that the living body is a chemical laboratory where varied and complex transformations of matter are taking place incessantly. Then, another milestone that was neglected along the years was of Mel Simpson at Yale. And Mel Simpson found something that was thermodynamically paradoxical, that protein degradation requires energy. And, as Avram explained to you yesterday, it didn't make any sense because proteins are high energy ingredients, so why to invest further energy in order to degrade them to amino acids, but nevertheless, this is protein degradation in Mel's experimental system. And when he changed the atmosphere in the incubator from oxygen to nitrogen, protein degradation ceased altogether. Obviously he didn't understand the explanation, he didn't have the ubiquitin system at hand and he didn't know what's going on. But he concluded that this is an energy requiring process. Then came a wonderful scientist, Christian de Duve, and he discovered the lysosome and he shared the Nobel prize in the mid '60's, along with others that discovered other organelles of the cell. And this is the lysosome. And the lysosome is an organelle secluded by a membrane and contains inside its lumen proteases. And this provided the explanation that the mechanistic base for protein degradation. So people knew that proteins are degraded and here came the mechanism. And the field actually between the mid '50's, when this discovery was made, to the mid '70's fell into dormancy, because people thought, well, there is nothing to study anymore. And the problem was only how proteins get into the lysosome. So for extracellular proteins like glycan, like the LDL core particle or the insulin, they are binding to receptors, going via endocytosis, receptor mediated endocytosis, and then are transported by a series of vesicles into the lysosome, these vesicles fuse, they pour their contents and their proteins are degraded. For intracellular proteins, microautophagy, you see this pinching of small droplets of the cyctosol, and these contents fuse, they make vesicles and then they fuse, pour their contents and degraded. So both extracellular proteins and intracellular proteins were assumed to be degraded by the lysosome. And then doubts started to be casted, this taken from a review of Fred Goldberg, Bob Shimky actually preceded him by this assumption. Here you can see the different proteins, doesn't matter even which, have different halflife times, like some proteins are living in the cell for merely few minutes, like ornithine decarboxylase. Other are living for more than 15 hours. And you heard that even for a single protein, like cycline, you heard it from Tim Hunt, for certain part of the cell cycle they are very stable, and then, all of a sudden, they are gone. This couldn't be explained based on the lysosomal theory, because the lysosome by pinching of droplets of the cytosol should degrade all the proteins at the same very rate, because proteins are not resistant to the activity of the lysosomal proteases. So these findings of the different various halflife times, and even changing halflife for specific proteins, could not be explained based on the lysosomal theory. And I would say that one of the last nails in the coffin of the lysosome is the main organelle that targets intracellular proteins came from Brian Poole. And Brian Poole was working actually in the laboratory of Christian de Duve at the Rockefeller University, so it's very nice how things cohere. And he did a very elegant experiment that I will not tell you all the details of, but he was able to inhibit lysosomal degradation by using a simple drug that we are all using against malaria, it's called Chloroquine, it kills the malarial parasite. And Chloroquine is known to increase the intralysosomal pH, I fail to tell you that the lysosomal proteases act optimally only at a low pH, which is provided by the acidic environment in the intralysosomal milieu. It's about 5 - 5.5 and while you are treating cells with Chloroquine, Chloroquine is the base, it goes in to the lysosome, gets protonated and dissipates the low intralysosomal pH, so the lysosome is shut down. And what Brian Poole did, he asked himself whether, when he shuts down the lysosome, both extracellular and intracellular proteolysis are being inhibited. And the answer was no, only extracellular proteolysis is being inhibited while there is no effect on inhibition of the lysosomes on intracellular proteolysis. And he summed it up in a beautiful poetic way that basically for us, though I cannot link things datewise, was kind of a green light: Yes, you can go ahead and search what you are looking for. And the summary goes as follows: Exogenous proteins, meaning extracellular proteins will be broken down in the lysosome, because the degradation is inhibitable by lysosomotropic agents. While endogenous, intracellular proteins will be broken down wherever it is that endogenous proteins are broken down, wherever it is. So we were after the 'wherever it is'. And I was a graduate student with Avram, and Avram told you yesterday the history, the fractionation of the reticulocyte lysate, beautiful elegant biochemistry at its best. And we found a conjugation machinery that takes protein for the final terminal destination. I just show you the mechanism in a snap shot, I will not go through the details. It's basically a 3-step mechanism and I tell you also why it was a very important one. The first, the target protein is being recognised by an enzyme called ubiquitin ligase, this is the enzyme that ligates ubiquitin, the death tag to the protein, there are about 1,000 ligases in the data base. Just to be accurate, there are about 22,000 and few hundred proteins in the human genome, not counting obviously gene splicing products like MHC class I molecules, T-cell receptors, antibodies, but straight genes. So the ubiquitin, just the ligases comprise about 5% of the total human genome. This is a specific recognition, only specific substance has to be targeted or recognised by specific ligases. In parallel, so this is the first step, recognition. Second step is tagging, here is ubiquitin, it's being activated by an enzyme called E1, 1E1 in the human data base. Activation, that step requires ATP, this solves the problem why we need ATP, I will not go through the details. And then, via E2, so it's a cascade reaction, it's transfer of ubiquitin from one enzyme, from E1 to E2, and then to the substrate we are building polyubiquitin chain. And this polyubiquitin chain, so the second step is tagging, recognition, tagging and now degradation. Here comes the protease, it's a huge 2 megadalton protease that recognises only polyubiquitin proteins and send them to the final destination. The polyubiquitin chain binds, basically the polyubiquitin chain is a recognition element in trans, it binds the substrate to the protease, the substrate get unfolded, injected into the proteolytic core that you heard yesterday, partially by professor Robert Huber and degraded into peptides. The beauty of this mechanism and why it was away from any paradigm, that it allowed the process to occur in one compartment, because otherwise proteases and substrates cannot live in the same compartment because it will be chaotic, if not destructive to the cell. So we have kind of a barrier here, the protease will never recognise the substrate unless the substrate is being tagged. And this immediately shifted all the attention in the field to why certain substrate are being tagged at a certain time point. And the proteolytic process remained kind of in the backyard. So the specificity and the recognition became immediately the focus of research in the field, but it immediately explained why everything can occur in the same compartment. While in the lysosome we needed the fence, the membrane to separate between the shark and the bait. So this is the ubiquitin system. Let's go now, and the ubiquitin system, as I told you, is hierarchical, single E1, transfers ubiquitin to about 50 E2s, each E2 talks to about more E3's, there are about 1,000 in the data base and each E3 will polyubiquitinate a certain subset of substrate and that once polyubiquitinated will go to the proteasome to be shredded. Now, let's go to diseases, let's jump to the other part of the talk very quickly. And normally, this is the ubiquitin system, proteins are in a steady state and we are facing a problem in one of two cases. Either a protein is overly degraded, excessively degraded or it's underdegraded. Let's say that the ubiquitin ligase is overexpressed, it will take the protein down or there is a mutation in ubiquitin ligase or in the recognition motif of the substrate, the protein will accumulate and in both cases we are into a problem. Now, we can go back to the old slide that I showed you and can tell you that in each section of the functions of the ubiquitin system there was a whole group of diseases discovered. And I'll go briefly through just two of those functions of the ubiquitin system again, the quality control and control of processes. Quality control will remove the nature misfolded proteins. Basically in all neurodegenerative diseases you will find accumulation of proteins that should have been degraded and are not degraded. And you will find it in Parkinson, you will find it in polyQ expansion diseases, in Huntington disease, spinocerebellar ataxia, Kennedy disease and so on and so forth. This is just one case. We learned a lot about it, not from the family onset diseases but rather from the genetic diseases, that are more rare, in this case you have Alzheimer. These are sections of Alzheimer brains from patients, it was done in Holland by Doctor Van Leuven, from Amsterdam. And these are, you see here staining for ubiquitinated proteins and in this case the patients have a transcript misreading of ubiquitin. So ubiquitin is being translated with an extension of 20 amino acids, it's a misfunctional ubiquitin, it can be conjugated, it cannot be conjugated, the cell sense less of ubiquitin and a disease ensues. Avram mentioned yesterday, I think in the discussion or during his talk, Parkinson, there is a juvenile form of Parkinson that erupts at an early age, in the third and fourth decade in life. There is a protein called Parkin, Parkin is a ubiquitin ligase, Parkin is mutated, probably a certain protein that should be targeted by Parkin is not targeted, it's accumulated and it becomes neuro toxic. So here you can see how the defect in the ubiquitin system leads to development of neuro degenerating diseases. Let's go to control of processes and the best studied diseases or set of diseases are malignancies. And here I shall go into more details and show you really how drugs, how people are thinking about drugging the system. Now, let's go to cancer. And we can, again Avram showed it to you yesterday, we can imagine cancer as a balance of kind of quality control in the cell. I mean, all the time we are mutating our cells, we are causing them damage, we are stressing them and they are balanced mechanisms that have to take care of it. The most studied one is obviously p53 and I'll come back to p53. and it will initially immediately stop the cell cycle, try to repair the damage, and if the damage cannot be repaired, it will induce apoptosis. So it's kind of a timelined reaction. And we can imagine that if there will be an increase degradation, overdegradation of a tumour suppressor like p53, the cell will be immediately exposed to malignant transformation. And that's what exactly occurs in human papilloma virus induced uterine cervical carcinoma, the virus encodes an oncogene called E6. This oncogene heterodimerises to p53, the ubiquitin system is misled to think, to identify this heterodimerise p53 as a denatured, wrong foreign protein, disposes it and the cell is out of p53 and out of the p53 checkpoint pathway. And the viruses now can go, this is an early gene, E6, and now the virus can go on and integrate its DNA into the cellular DNA. If the virus wouldn't have gotten rid of p53 and would have gone directly for the integration event, the p53 would have jumped up because it would have sensed some DNA damage and would have tried either to repair the damage or, if failing, to apoptose the cell. So the virus has evolved, think about it evolutionary, a strategy to remove the alarm system from the cell in order for it to allow it to propagate and to replicate, very elegant mechanism. On the other hand, oncogenical growth promoting protein that will not be degraded, like a mutated EGF receptor, that will keep on signalling to the cell non-stop, or beta-catenin in the wind signalling pathway, that will not be degraded, will keep on signalling to the cell non-stop, will cause cancer. We know that the machinery that degrades beta-catenin is defective in many, many cases of colorectal carcinoma, malignant melanomas and many others, breast carcinomas with EGF receptor and so on and so forth. So we know that under-degradation of a growth promoting protein, over-degradation of a tumour suppressor, is bad for us. Now, if we are thinking of drugging the system, mutations are more difficult to treat. I mean, loss of function is always in concept more difficult to treat than gain of function. Think about pharmacology today, we are treating hypertension by beta blockers. We are treating all kinds of diseases by inhibiting processes that are working in excess than interfering with mutations. You know, treating mutations typically throws us into the big swamp of genetic treatment and here the ubiquitin system is obviously not an exception. But let's go to drugging of the system and we shall go step by step. And the first inhibitor that was developed was an inhibitor to the proteasome. And this didn't make any sense. I mean, drugwise it didn't make any sense because if the ubiquitin system is so important and if we are going to inhibit the proteasome, then the patient will, if not dying, at least develop severe side effects. But it did work and it did work magically and because some cells are more sensitive even to partial inhibition than others. And I'll show you, this is the drug, Avram mentioned it yesterday, it's Velcade and it's a specific inhibitor of the active side of the proteasome. And it's an aldehyde boronic acid derivative and it's being used now in two diseases but it's a new drug. And it was just approved by the FDA a few years ago and it's being expanded all the time. Here is a patient with multiple myeloma, for those of you who are not haematologists or in the field, it's a monoclonal expansion of an immune cell in the bone marrow. And the immune cell suppresses all the normal progenitors in the bone marrow, it's a deadly disease. All the progenitors are not there, because of the pressure there are vertebra fractures, long bone fractures, it's a deadly disease, very bad disease. And here you can see this, in this case the oncologists are lucky because they can follow a biomarker which is not the case in many malignancies. Here you can see the galloping immunoglobulin that is secreted by the cell, conventional treatment started, the patient responds partially, relapses and here started treatment with this inhibitor and the patient responds favourably. About 5% of the patients go into a very long remission which was unheard before. And the challenge is now, is to genetically profile these patients and to understand the differences between the responders, the partial responders and the non-responders. But this belongs to what we call now, in modern medicine, personalised medicine. We are moving from general medicine into personalised medicine and into a completely different way of how we look at patients and the response to treatment. This is the bone marrow of the patient, you can see without being histo- or hematopathologist, you can immediately tell that this bone marrow is malignant, inhomogenous, full with malignant cells. And the following treatment, you can see that the malignant cells went down from 40% to 1%. And the bone marrow is enriched again with a normal progenitor. This is another patient with Non-Hodgkin lymphoma, it's another disease of the immune system and without going into details, you can see here the tumour that sits in the right hilum of the lung. These are the big vessels, the sternum, the vertebra, the spinal canal, the scapula, the muscle of the shoulder, the ribs. And you can see here the tumour that regressed following a treatment. Now, let's go to the next, to the future. And what I want to do now, in the last 5 minutes of my talk, is just take you very quickly to the future and show you how we think. So the first treatment was clearly non-specific, it produced apoptosis on the cell but it doesn't make sense to drug and to inhibit the proteasome and many diseases will not. So people are trying to go more and more into specific treatments and I'll take you through the specific treatments. So we know that in the cell one of the quality control mechanisms are chaperons. And chaperons are proteins that are trying to refold misfolded proteins and if they are unable to do it, they deliver them to the ubiquitin system for degradation. But from time to time they play the wrong role. Instead of, on one hand, they cannot refold the proteins that they should refold, but on the other hand they bind them irreversibly and cannot deliver them for degradation. So we get stuck and the mutated proteins get protected from degradation. So basically we can say that these HSP proteins, these chaperones, they are acting as evolutionary capacitors of mutations, they just augment mutations. So the idea will be to develop dissociators that will take the mutated proteins away from its protector. So that's what people did and there are several drugs already in trials, and one of them is Geldanamycin, it's too toxic but the concept is there. Another one is 17-AAG and I'll show you just one example. And here you can see the HER neu receptor, the same one that is targeted by Herceptin, is here fluorescently labelled and following treatment with the dissociator from the chaperone, the fluorescent is gone, the receptor has been degraded. And you can see here actually the real biochemistry of how it works, it's really beautiful. This is the receptor, the protein, this is the activity of the receptor, the tyrosine protein kinase. So here we are measuring with specific antibodies that recognise phosphor tyrosine. And you can see that once we are increasing the concentration of the dissociator, this guy here on the left, you are increasing the amount of ubiquitin conjugate, so you send the receptor to its final destination. The protein goes down, but what's really impressive is that the activity is going down. The phosphor tyrosine kinase activity is almost gone. Now let's go to patients, I mean we are moving to patients, these are a little bit not so nice diseases but we are in medicine. So this is a patient with spread squamous cell carcinoma of the face, you see 40 days later the face is much better, this is just an ulcer, so the tumour was ulcerated, was necrotised. And 80 days later you can all tell much improvement, with single modality therapy. So here you have a mechanism-based treatment, we release a mutated active protein from its capacitator and send it for destruction and the patient improve. Let's go to the next generation of drugs, which is really the future and the human experiments are still at the very initial phase. Let me go back to p53, as I told you p53 is a critically important protein. In 50% of all tumours across the board it's mutated and in another 50% of the remaining 50%, namely 25%, it's underrepresented, it's overly degraded. So it's a huge major player in malignant transformation. And every single stress, ribonucleotide depletion, DNA damage, nitric oxide, will cause p53 to jump up. If it's not mutated, I'm talking only on the wild type, it will immediately stop the cell cycle, because a cell that is stressed cannot proceed. Will induce DNA repair, and if not, will induce apoptosis. And let's forget about senescence. So p53 is our good guy, oncogenic stress increases, activates p53 to prevent cancer, it's oversimplified but it's awfully true. Now, in those cases the p53 is the wild type but it's nevertheless underrepresented, it's underrepresented because its ubiquitin ligase, its executioner is over expressed. Basically the Hdm2, which is the ubiquitin ligase, the executioner of p53, becomes an oncogene, it's up-regulated in an uncontrolled manner and ubiquitinate and degrades p53. So it makes sense to develop a small molecule inhibitor that will just cut off this vicious circle and then we don't care that Hdm2 is present, you know, it can be there but it will be inhibited. And that's exactly what happened. Drug companies developed a drug, an inhibitor, the inhibitor is called Nutlin. And again the beauty of it, that we are now, we are out of high throughput assays, screening libraries of zillion compounds, it's a well designed drug. It's well designed because the 3-dimensional structure of Hdm2 is known, in this case it's the mouse enzyme, the Mdm2. And this is the pocket in which p53 is sitting. You are designing a small molecule that occupies the pocket, the pocket is being competed and p53 just cannot go there and it stays alive. It's not ubiquitinated and not degraded. And here is the experiment. You can see that once we are adding Nutlin, p53 is going up, the ligase is also going up because the ligase is a downstream gene to p53, but we don't care that the ligase goes up because there is Nutlin in the medium. So every molecule of Mdm2 that will be synthesised immediately will be inhibited by the drug. And as a matter of fact, what you can see that P21 that is also down stream gene to p53, that is a cell cycle inhibitor, is induced by the active p53. And looking at facts analysis, you can see immediately that in non-treated cell, 45% of the cells are cycling, they are synthesising DNA. While following Nutlin treatment, 5% are in the cell cycle. So we pushed 40% of the cells out of the cell cycle. And here is a SCID mouse that was injected with tumour cells, with 1 million tumour cells. And you can see that the tumour is growing in volume. This is the tumour volume and here the tumour is treated, one treatment is Doxorubicin. Doxorubicin is a highly toxic, non-specific chemotherapeutic agent, it's a DNA intercalator, it's an oxyderivative of the nucleotide and it goes into DNA and it makes abnormal DNA. And here you can see a very specific ubiquitin ligase inhibitor, Nutlin here, the scores have the same effect as a broad spectrum highly toxic chemotherapeutic agent. So if you go back to my story of the drugs, you can see the gradation, not the degradation, the gradation. And the gradation is from non-specific treatment of the proteasome to more specific treatment of chaperones, but it's still too broad because there are many proteins that are being capacitated, that are being held by the chaperones to a very specific missile targeted treatment of ubiquitin ligase. And this is the future. Let me just end with something that I took from Craig, the signing, but I want also to tell you there is a habit in the Nobel museum that laureates are signing chairs, the bottom of chairs, but then not all of them sign the same chair from the same year, but they take the chair, they let you sign and then they stash it for a few years and then they take it out again. And it takes about several good years to fill the bottom of the chair. So this is Richard Axel signing the chair and I took a picture. But then I took a picture of the chair that I signed and, you know, I was so excited, I didn't notice. So then I went back home and looked at it and I thought that I closed the cycle, a very nice cycle. So that's me signed here. Then I looked at the two other guys that signed it. So one of them is a very close friend of mine that you heard here, and that's Tim Hunt, you see Tim Hunt. And you see the cell cycle, you see the mitosis. This is the logo of Tim. So you see the mitosis, you see the G1, the S way that we were just talking about, with the Mdm2 and you see the G2 and here it says the cell cycle. Now, why for me it's the closure of a cycle, not only that Tim is a dear friend, but the cell cycle rides completely on the ubiquitin system because all the inhibitors and the accelerator, the P21, P27, cyclin, cyclin dependent kinase inhibitors, Avram just showed you his wonderful work yesterday, is riding. So it's going from the process to the mechanism, so it linked me back. The other one that signed here is Ahmed Zewail, he's Egyptian by origin but working in Caltech, he's also laureate in chemistry. And for me, to be on the same chair with an Egyptian, maybe it has some trajectory to the future. Maybe by talking science we can talk also peace, thank you very much. Thank you very much, that was a very nice talk. So we have time for a few questions. So Professor, thank you. I would like to ask a question related to an interesting phenomenon in another system. When we increase the activity of neurons, we find that some special kind of proteins are selective degradated by ubiquitin proteasome system. Why if we decrease the activity we got opposite results. So my question is: In your opinion, how the ubiquitin protein system can be precisely regulated for the degradation of a special kind of proteins, and why not others in the same cells? So thank you. Ok, the question, if I understood it well, has to do with the specificity of the system and how the ubiquitin system selects its certain substrate. It has to do with the substrate itself in most cases, but also with the elements of the ubiquitin system. So for example let's take nf-kappaB activation, which is a very important transcription regulation that regulates the immune system and is linked to chronic inflammation and then to cancer. It's also a strong anti-apoptotic and it's activated by the ubiquitin system. So following signalling, let's say by TNF alpha, you are phosphorylating very specific serine residues on the molecule, on the inhibitor of the molecule. On I kappa B alpha and I kappa B beta. And these two specific phosphorylations that are set three aminoacids from one another, so it's threonine 32 and threonine 36, will be specifically recognised by a very specific ubiquitin ligase. So only this protein that has these two serines and these two serines were specifically phosphorylated by the specific kinase, will be tagged at this moment, all other proteins will be spared. And the same can go for p27, so the work of Michele Pagano and Avram. So p27, which is a cell cycle inhibitor, will be phosphorylated on threonine 187 and only following this phosphorylation a specific ubiquitin ligase called SKIP2 will come and take it away. It doesn't mean that phosphorylation has just picked up two examples from phosphorylation and how phosphorylation and signalling are feeding into the ubiquitin system, but there are many signals. Take HIF-1 alpha, for example, in sensing of oxygen, the wonderful work of Bill Kaelin from Harvard and Peter Ratcliffe from Oxford. So normally, when we are in a normoxic environment, in high oxygen pressure, we don't need to induce all these oxygen sensitive genes like VGF and VGF receptor in order to vascularise it, because we have enough oxygen. But only in low oxygen this VGF and VGF receptor endogenetic reaction is being stimulated. How it's being regulated by a protein called HIF-1 alpha or hypoxia inducible factor, it's a very potent transcriptional regulation. Under hypoxia it's all the time oxidised. And once it's oxidised on a specific proline residue, a specific ubiquitin ligase called the Von Hippel-Lindau protein will come and take it away because it recognises the specific proline, hydroxyproline. Under low oxygen there will be no hydroxylation, HIF-1 alpha will be up and will induce all the downstream gene. So I just try to bring you two examples, but the secret is always in specific recognition and therefore we need this huge repertoire of ubiquitin ligases. Could you tell us about prion degradation. Prion degradation, you should have Stanley Prusiner here to tell you about prion degradation. Prion is extracellular, but it goes in and it has to do with the ubiquitin system. I can just point out to a wonderful work that still is in the process and we still don't know, and that is the secretion of the prion on its way out, that also somehow involves the proteasome, and that's the work of Susan Lindquist from the Whitehead Institute in Boston. And she claims that if you inhibit the proteasome, somehow you also accumulate the prion particle and you may induce even, you know, the conversion of the PrPC into the PrPsc particle, and you may induce prion disease. And then, you know, being sick is not good, but then you have to choose between the bad and the worse. Do you want to die of prion disease or of multiple myeloma, I don't know, I mean it's a bad choice. But we still don't understand obviously the full scope, because the ubiquitin system is so complex and is involved in so many processes that we don't understand the sequel of it. Thank you.

Ich habe das Vergnügen Ihnen den nächsten Vortragenden anzukündigen, Herrn Professor Aaron Ciechanover vom Technion in Haifa, Israel. Er erhielt den Nobelpreis für Chemie zusammen mit Avram Hershko, der seinen Vortrag gestern gehalten hat, und Irwin Rose für die Entdeckung des ubiquitin-vermittelten Proteinabbaus. Seit er den Preis in Empfang genommen hat, ist Professor Ciechanover jedes Jahr in Lindau – er mag diese Stadt ganz offensichtlich. Wir möchten ihm für sein Wohlwollen bezüglich dieser Veranstaltung und seine Unterstützung danken. Sein heutiger Vortrag handelt von der Dynamik unserer Proteine von den zugrunde liegenden Mechanismen bis zum Patientenbett. Bitte, Aaron. Ich möchte mich Richard Roberts Empfehlung bezüglich zukünftiger Projekte bzw. Forschungsvorhaben von Studenten anschließen. Wenn ich selbst heute wählen müsste, würde ich mich für die Mikrobiologie und Virologie entscheiden, und zwar nicht nur, weil diese Gebiete faszinierend, sondern auch weil sie so enorm wichtig sind. Allein wenn wir uns die letzten 30 Jahre mit Legionellen, Ebola, Vogelgrippe und AIDS ins Gedächtnis rufen, wird uns klar, dass wir uns auf dünnem Eis bewegen. Nur ein paar Mutationen hätten bei all diesen Organismen dazu führen können, dass sie weitaus virulenter sind, und uns ins Mittelalter mit der schwarzen Pest zurückgeworfen. Irgendwie haben wir uns eingebildet, wir hätten die Infektionskrankheiten besiegt, und die Regierungen haben, wie Richard bereits sagte, die Mittel eingefroren. Doch das war nur eine Illusion. Lassen Sie mich also mit meinem Vortrag beginnen. Ich werde versuchen, Überschneidungen mit dem gestrigen Vortrag meines Mentors zu vermeiden und dessen Inhalt nur am Rande zu berühren. Ich werde Ihnen ein wenig über die Geschichte der Proteolyse im Ubiquitin-System erzählen, und zwar nicht nur um denjenigen Menschen Tribut zu zollen, die diesen Forschungsbereich etabliert haben, da ich denke, dass wir keine Randfiguren sind, sondern eine definierte Rolle in der Mitte spielen, aber auch um Ihnen zu zeigen, dass Sie, wenn Sie ins Labor gehen und ein neues Projekt starten wollen, wirklich wissen müssen, was andere Leute in diesem Bereich bereits geforscht haben. Dann werden Sie feststellen, dass Sie von zahlreichen Meilensteinen umgeben sind und nur die Fäden zusammenführen und dann auf dieser Grundlage neues Wissen generieren müssen. Danach werde ich Ihnen die Geschichte der eigentlichen Entdeckung im Einzelnen erzählen und dann direkt ihre Anwendung in der Medizin erläutern. Ich werde Ihnen zeigen, wie Medikamente – aktuelle und zukünftige – entwickelt werden und welchen Weg die Pharmafirmen dabei spielen. Es geht also um die Proteolyse, einen alten Prozess, den wir gut kennen und bei dem Aminosäuren hydrolysiert werden. Sie findet im Körper in verschiedenen Organellen statt. Entscheidend ist die Topologie im Magendarmtrakt. Der Prozess ist einfach: Jedes Protein, das hineingelangt, wird unspezifisch abgebaut. Eliminierung der Antigenität, Gewinnung von Energie aus Nährstoffen, alles bekannt. Wenn wir uns in den Körper begeben – hier befinden wir uns noch im Kreislauf, also extrazellulär, intrakorporal – treffen wir nur auf sehr begrenzte, jedoch hochspezifische Proteolysesysteme. Bei einem dieser Systeme, das Professor Robert Huber gestern erwähnte, dem Blutgerinnungssystem, handelt es sich um eine Bonafide-Kaskade proteolytischer Ereignisse. Am Ende wird Fibrinogen in Fibrin umgewandelt und es entsteht ein Blutgerinnsel. Wir wissen, was bei einem pathologischer Prozess geschieht: Hyperkoagulation, Myokardinfarkt, Hypokoagulation, eine ganze Reihe genetischer Erkrankungen, Hämophilie. Doch das hier sind beschränkte Prozesse. Gehen wir jetzt in die Zelle. Dort finden mehrere proteolytische Prozesse statt. Als ich Doktorand war, kam ich in das Labor von Avram und wir interessierten uns für diesen Prozess. Es stellte sich heraus, dass er ausgesprochen weitreichend ist. In unserem Körper geschieht Folgendes: Wir setzen die Proteine um, bauen sie ab und synthetisieren sie erneut, und zwar in einem erstaunlichen Tempo. Die Frage ist warum. Es gibt verschiedene Gründe, warum dies geschieht, einer davon ist offensichtlich die Qualitätskontrolle. Viele Proteine werden in der Natur aus den unterschiedlichsten Gründen falsch gefaltet. Unsere hohe Körpertemperatur von 37° beispielsweise ist für Proteine schädlich, ebenso der hohe Sauerstoffgehalt von 21%. Offensichtlich gibt es viele gute evolutionäre Gründe, warum unsere Körpertemperatur bei 37° liegt und die Atmosphäre 21% Sauerstoff enthält. Andererseits ist dies für die Proteine schädlich und wir müssen sie austauschen. Wir steuern Prozesse – Sie haben die beeindruckenden Vorträge von Tim Hunt und Avram gestern gehört. Es gibt sehr gute Proteine, aber wir benötigen den Prozess nicht mehr. Die Zellteilung, die Zelle, der gesamte Zellzyklus wird von einer ganzen Reihe von Bremsen und Gaspedalen gesteuert, die zu bestimmten Zeitpunkten eliminiert werden müssen. Das ist ein weiterer Grund, Proteine zu einem bestimmten Zeitpunkt abzubauen. Offensichtlich müssen wir bestimmte Proteine zu bestimmten Zeitpunkten dauerhaft entfernen, um den differenzierten und morphogenetischen Zustand des Gewebes beizubehalten, ein Prozess, der sich bei malignen Erkrankungen umkehrt. Lassen Sie uns nun ein bisschen die Geschichte beleuchten. Meiner Ansicht nach ist der Gründungsvater Rudolf Schönheimer, ein deutscher Jude, der bei der Machtergreifung der Nazis in die Vereinigten Staaten ging und an der Rockefeller University in New York tätig war. Zusammen mit Harold Urey wandte er ein ganz einfaches Verfahren an: er fütterte Ratten mit markierten Aminosäuren und stellte fest, dass die Aminosäuren in die Proteine hinein und wieder aus ihnen hinaus gelangten. Er zog daraus den Schluss, dass sich Proteine bzw. Körperbestandteile in einem dynamischen Zustand befinden, und veröffentlichte 1942 bei der Harvard University Press eine kleine Monographie mit dem Titel „Über den dynamischen Zustand der Körperbestandteile“. Rudolf Schönheimer starb früh; hier ist seine Todesanzeige aus der New York Times von 1942. Daraus gehen die Umstände seines Todes klar hervor, aber auch, dass er mit seiner Arbeit dazu beigetragen hat, die Betrachtung des lebendigen Körpers als chemisches Labor, in dem unentwegt verschiedene komplexe Stoffumwandlungen stattfinden, zu etablieren. Ein weiterer Meilenstein, der im Laufe der Jahre vernachlässigt wurde, war der von Mel Simpson in Yale. Mel Simpson fand etwas thermodynamisch Paradoxes heraus, nämlich dass für den Proteinabbau Energie notwendig ist. Wie Avram Ihnen gestern bereits erläutert hat, ergab dies keinen Sinn, denn Proteine sind hochenergetische Komponenten. Warum also in den Abbau zu Aminosäuren zusätzliche Energie investieren? Gleichwohl werden in Mels experimentellem System Proteine abgebaut. Als er die Atmosphäre im Inkubator von Sauerstoff auf Stickstoff umstellte, kam der Proteinabbau völlig zum Stillstand. Offensichtlich verstand er die Erklärung nicht, ihm stand das Ubiquitin-System noch nicht zur Verfügung und er wusste nicht, was vor sich ging. Er kam aber zu dem Schluss, dass es sich dabei um einen Prozess handelt, der Energie benötigt. Dann kam ein wunderbarer Wissenschaftler, Christian de Duve. Er entdeckte das Lysosom und erhielt dafür zusammen mit anderen, die weitere Zellorganellen entdeckt hatten, Mitte der 60er Jahre den Nobelpreis. Das ist das Lysosom, eine von einer Membran umschlossene Organelle, die in ihrem Lumen Proteasen enthält. Es lieferte die Erklärung, den zugrunde liegenden Mechanismus des Proteinabbaus. Man wusste, dass Proteine abgebaut werden; jetzt folgte der Mechanismus. Von Mitte der 50er Jahre, als diese Entdeckung gemacht wurde, bis Mitte der 70er Jahre fiel dieses Forschungsgebiet in einen Dornröschenschlaf, denn man dachte, dass es nichts mehr zu erforschen gäbe. Das Problem war lediglich, wie die Proteine in das Lysosom gelangen. Extrazelluläre Proteine wie Glycan, LDL-Teilchen oder Insulin binden sich an Rezeptoren, d.h. es erfolgt eine rezeptor-vermittelte Endozytose. Dann werden sie durch eine Reihe von Vesikeln in das Lysosom transportiert. Die Vesikel verschmelzen und verströmen ihren Inhalt, anschließend werden die Proteine abgebaut. Bei intrazellulären Proteinen kommt es zur Mikroautophagie. Sie sehen hier diese abgeklemmten kleinen Zytolsoltröpfchen. Ihr Inhalt verschmilzt, es entstehen Vesikel, die ebenfalls verschmelzen, ihren Inhalt verströmen und abgebaut werden. Man nahm an, dass sowohl extrazelluläre als auch intrazelluläre Proteine durch das Lysosom abgebaut werden. Dann traten erste Zweifel auf; das hier stammt aus einem Review von Fred Goldberg, aber Bob Shimky kam ihm mit seiner Vermutung eigentlich zuvor. Hier sehen Sie die unterschiedlichen Proteine; es ist eigentlich unwichtig, welche. Sie haben verschiedene Halbwertszeiten; einige Proteine leben in der Zelle nur ein paar Minuten wie z.B. Ornithindecarboxylase, andere mehr als 15 Stunden. Sie haben von Tim Hunt gehört, dass dies selbst bei einem einzelnen Protein wie Cyclin der Fall ist; in einem bestimmten Abschnitt des Zellzyklus sind sie äußerst stabil und plötzlich sind sie verschwunden. Das ließ sich mit der Lysomomtheorie nicht erklären, denn das Lysosom sollte infolge der abgeklemmten Zytosoltröpfchen alle Proteine mit derselben hohen Geschwindigkeit abbauen, da Proteine der Aktivität der lysosomalen Proteasen nicht standhalten können. Diese unterschiedlichen bzw. bei bestimmten Proteinen sich sogar verändernden Halbwertszeiten konnten also durch die Lysosomtheorie nicht erklärt werden. Ich würde sagen, dass einer der letzten Nägel im Lysosomsarg die von Brian Poole entdeckte wichtige Organelle war, deren Target intrazelluläre Proteine sind. Brian Poole arbeitete im Labor von Christian de Duve an der Rockefeller University – ein wirklich hübscher Zufall. Er führte ein sehr elegantes Experiment durch, das ich Ihnen nicht im Detail erläutern möchte, aber er konnte den lysosomalen Abbau mittels eines einfachen Malariamedikaments namens Chloroquin, das die Malariaparasiten abtötet, inhibieren. Chloroquin erhöht bekanntermaßen den intralysosomalen pH-Wert. Ich habe Ihnen noch nicht gesagt, dass die lysosomalen Proteasen am optimalsten bei einem niedrigen pH-Wert von ca. 5 bis 5,5 arbeiten, wie er in der sauren Umgebung des intralysosomalen Milieus vorliegt. Bei der Behandlung der Zellen mit Chloroquin als Basis gelangt dieses in das Lysosom, wird protoniert und erhöht den niedrigen intralysosomalen pH-Wert, so dass das Lysosom abgeschaltet wird. Brian Poole fragte sich, ob sowohl die extrazelluläre als auch die intrazelluläre Proteolyse bei dieser Abschaltung des Lysosoms inhibiert werden. Die Antwort war nein, nur die extrazelluläre Proteolyse wird inhibiert; ein Effekt auf die Inhibition der Lysosome, auf die intrazelluläre Proteolyse fand sich nicht. Sein wunderbar poetisches Fazit, das uns sozusagen grünes Licht gab auch wenn ich mich an keine zeitliche Verknüpfung erinnere, lautete wie folgt: Exogene Proteine, d.h. extrazelluläre Proteine werden im Lysosom aufgespalten, denn der Abbau kann durch lysosomotrope Substanzen inhibiert werden. Die Aufspaltung endogener, intrazellulärer Proteine erfolgt dagegen an einem anderen Ort, wo auch immer dieser sich befindet. Jetzt ging es darum dieses “wo auch immer” zu finden. Ich war Doktorand bei Avram, und Avram hat Ihnen gestern die Geschichte von der Fraktionierung des Retikulozytenlysats erzählt, schöne elegante Biochemie vom Feinsten. Wir entdeckten einen Konjugationsmechanismus, der das Protein seiner endgültigen Bestimmung zuführt. Ich zeige Ihnen den Mechanismus kurz in einem Schnappschuss, ich werde nicht ins Detail gehen. Es handelt sich im Grunde genommen um einen 3-stufigen Mechanismus, und ich sage Ihnen auch, warum er so wichtig ist. Das Zielprotein wird zunächst von einem Enzym namens Ubiquitinligase erkannt. Das ist das Enzym, mit dem sich das Ubiquitin an das Protein bindet, sozusagen seine Markierung. Es gibt etwa 1000 Ligasen in der Datenbank. Um genau zu sein, umfasst das menschliche Genom etwa 22.000 und ein paar Hundert Proteine, wobei offensichtlich Genspleißprodukte wie Moleküle der MHC-Klasse I, T-Zellen Rezeptoren und Antikörper nicht mitgezählt werden, sondern nur gewöhnliche Gene. Die Ubiquitinligasen machen etwa 5% des gesamten menschlichen Genoms aus. Es handelt sich um eine spezifische Erkennung, d.h. nur eine bestimmte Substanz ist das Target spezifischer Ligasen und wird von ihnen erkannt. Der erste Schritt ist also die Erkennung. Der zweite Schritt ist die Markierung, hier mit Ubiquitin, das durch ein Enzym namens E1 – oder 1E1 in der Humandatenbank – aktiviert wird. Für den Aktivierungsschritt wird ATP benötigt. Das löst das Problem, warum wir ATP benötigen, ich werde das hier nicht näher erläutern. Dann kommt E2 ins Spiel, es handelt sich also um eine Kaskadenreaktion, das Ubiquitin wird von einem Enzym (E1) auf das andere (E2) und schließlich auf das Substrat überführt. Es entsteht eine Polyubiquitinkette: Erkennung, Markierung und schließlich Abbau. Das hier ist die Protease, eine riesige Protease von 2 Megadalton, die nur Polyubiquitinproteine erkennt und sie ihrer endgültigen Bestimmung zuführt. Die Polyubiquitinkette – im Wesentlichen ein Erkennungs- oder trans-Element – bindet das Substrat an die Protease, das Substrat entfaltet sich, wird in den proteolytischen Kern, von dem Sie gestern u.a. von Professor Huber gehört haben, injiziert und zu Peptiden abgebaut. Das Schöne an diesem Mechanismus und der Grund dafür, dass er keine Lehrmeinung darstellt, ist, dass der Prozess bei diesem Mechanismus in einem Kompartiment stattfinden kann. Ansonsten können sich Proteasen und Substrate nicht in ein- und demselben Kompartiment aufhalten – das wäre chaotisch, wenn nicht sogar zerstörerisch für die Zelle. Wir haben also eine Art Barriere hier; die Protease erkennt das Substrat nur, wenn es markiert ist. Das lenkte die Aufmerksamkeit sofort auf die Frage, warum ein bestimmtes Substrat zu einem bestimmten Zeitpunkt markiert wird. Der proteolytische Prozess trat dabei in den Hintergrund. Spezifität und Erkennung rückten plötzlich in den Mittelpunkt der Forschung auf diesem Gebiet, und auf einmal wurde klar, warum alles im selben Kompartiment stattfinden kann, wohingegen im Lysosom ein Zaun notwendig ist, die Membran, die den Hai vom Köder trennt. Es war das Ubiquitin-System. Wie ich bereits sagte, ist das Ubiquitin-System ein hierarchisches System: Ein einzelnes E1 reicht Ubiquitin an etwa 50 E2 weiter, ein E2 spricht mit noch mehr E3 die nach ihrer Polyubiquitinierung im Proteasom abgebaut wird. Nun, gehen wir zu den Krankheiten weiter und springen rasch zum zweiten Teil des Vortrags. Normalerweise befinden sich die Proteine im Ubiquitin-System in einem Gleichgewichtszustand. Es können zwei Fälle auftreten, in beiden haben wir ein Problem. Entweder wird ein Protein zu viel oder zu wenig abgebaut. Sagen wir die Ubiquitinligase wird überexprimiert, dann wird das Protein vollständig abgebaut; tritt eine Mutation in der Ubiquitinligase oder im Erkennungsmotiv des Substrats auf, sammelt sich das Protein an. In beiden Fällen haben wir ein Problem. Nun, schauen wir uns noch einmal die alte Folie an, die ich Ihnen gezeigt habe. Für jeden Funktionsbereich des Ubiquitin-Systems wurde eine ganze Gruppe von Krankheiten entdeckt. Ich werden Ihnen zwei dieser Funktionen des Ubiquitin-Systems noch einmal kurz erläutern: die Qualitätskontrolle und die Prozesssteuerung. Durch die Qualitätskontrolle werden die von Natur aus falsch gefalteten Proteine eliminiert. In praktisch sämtlichen neurodegenerativen Erkrankungen findet sich eine Anhäufung von Proteinen, die abgebaut sein müssten, es aber nicht sind. Dies ist der Fall bei Parkinson, PolyQ-Erkrankungen, Morbus Huntington, spinozerebellärer Ataxie, Morbus Kennedy und so weiter. Dies ist nur ein Fall. Wir haben viel darüber gelernt, nicht bei Krankheiten innerhalb der Familie, sondern vielmehr bei den selteneren genetischen Erkrankungen, in diesem Fall Alzheimer. Dies sind Gehirnschnitte von Alzheimer-Patienten, sie stammen von Dr. Van Leuven aus den Niederlanden. Wie Sie hier sehen, sind die ubiquitinierten Proteine angefärbt; in diesem Fall ist es bei den Patienten zu einem Fehler beim Lesen des Ubiquitin-Transkripts gekommen. Das Ubiquitin wird mit zusätzlichen 20 Aminosäuren translatiert, ist daher nicht funktionsfähig und kann nicht konjugiert werden, die Zelle registriert weniger Ubiquitin und eine Krankheit entsteht. Avram hat das gestern erwähnt, ich glaube in der Diskussion oder während seines Vortrags: Es gibt eine juvenile Form der Parkinson-Erkrankung, die bereits relativ früh, nämlich im dritten oder vierten Lebensjahrzehnt ausbricht. Dabei ist das so genannte Parkin, eine Ubiquitinligase, mutiert und bindet sich deshalb vermutlich nicht an sein Zielprotein, so dass sich dieses Protein ansammelt und neurotoxisch wird. Hier können Sie sehen, wie der Defekt im Ubiquitin-System zur Entwicklung neurodegenerativer Erkrankungen führt. Gehen wir jetzt zur Prozesssteuerung. Die am besten erforschten Krankheiten sind Krebserkrankungen. Hier möchte ich etwas mehr ins Detail gehen und Ihnen zeigen, wie man das System mit Hilfe von Medikamenten beeinflussen möchte. Wenden wir uns also dem Krebs zu. Wie Ihnen Avram gestern schon gezeigt hat, kann man sich Krebs als Ungleichgewicht der Qualitätskontrolle in der Zelle vorstellen. Schauen Sie, wir lösen ständig Mutationen in unseren Zellen aus, fügen ihnen Schaden zu, setzen sie unter Stress, aber sie haben Mechanismen, die alles wieder ins Lot bringen. Am besten erforscht ist offensichtlich p53; ich werde darauf noch zurückkommen. p53 ist der Wächter des Genoms, er überprüft alle Arten von Stress und Schäden, stoppt sofort den Zellzyklus, versucht den Schaden zu reparieren bzw. induziert, wenn eine Schadensreparatur nicht möglich ist, die Apoptose. Es handelt sich also um eine Reaktion entlang einer Zeitachse. Wir können uns vorstellen, dass die Zelle, wenn es zu einem verstärkten Abbau eines Tumorsuppressors wie p53 kommt, sofort malignen Umwandungsprozessen ausgeliefert ist. Genau das passiert beim humanen Papillom-Virus, das Gebärmutterhalskrebs auslöst. Das Virus codiert ein Onkogen namens E6. Dieses Onkogen heterodimerisiert p53; das Ubiquitin-System erkennt dieses heterodimerisierte p53 nicht als denaturiertes, falsches Fremdprotein und lässt es passieren. Damit verfügt die Zelle über kein p53 und keinen p53-Kontrollmechanismus mehr. Bei E6 handelt es sich um ein frühes Gen – jetzt kann das Virus weitermachen und seine DNA in die der Zelle einschleusen. Hätte das Virus das p53 nicht eliminiert und direkt mit dem Einschleusvorgang begonnen, wäre das p53 sprunghaft angestiegen, weil es eine Beschädigung der DNA erkannt und versucht hätte, diese entweder zu reparieren oder, falls dies nicht gelingt, die Zellapoptose auszulösen. Das Virus hat somit – denken Sie evolutionstechnisch – eine Strategie entwickelt, das Alarmsystem der Zelle auszuschalten, damit es ihm erlaubt sich auszubreiten und zu replizieren; ein sehr eleganter Mechanismus. Andererseits wird ein onkogenes Wachstumsförderungsprotein, das nicht abgebaut wird oder Beta-Catenin im Wnt-Signalweg, das nicht abgebaut wird – ohne Unterbrechung Signale an die Zelle senden und Krebs erzeugen. Wir wissen, dass der Mechanismus, der Beta-Catenin abbaut, ganz häufig bei Kolorektalkarzinomen, malignen Melanomen, Mammakarzinomen mit EGF-Rezeptoren usw. defekt ist. Wir wissen somit, dass ein unzureichender Abbau eines Wachstumsförderungsproteins und ein übermäßiger Abbau eines Tumorsuppressors schlecht für uns sind. Nun, was die Beeinflussung des Systems durch Medikamente angeht, sind Mutationen schwieriger zu behandeln. Ich meine, ein Funktionsverlust ist prinzipiell immer schwieriger zu therapieren als ein Funktionsgewinn. Denken Sie an die Pharmakologie heute: Wir behandeln Bluthochdruck mit Beta-Blockern, wir behandeln alle Arten von Krankheiten, indem wir überschießende Prozesse inhibieren statt uns mit den Mutationen zu beschäftigen. Wissen Sie, bei der Behandlung von Mutationen geraten wir typischerweise in den genetischen Therapiesumpf, und das Ubiquitin-System macht hier offensichtlich keine Ausnahme. Beschäftigen wir uns also mit der Beeinflussung des Systems durch Medikamente; wir werden dabei Schritt für Schritt vorgehen. Der erste Inhibitor, der entwickelt wurde, war ein Inhibitor für das Proteasom. Das ergab keinen Sinn. Ich meine, vom medikamentösen Standpunkt aus ergab das keinen Sinn, denn wenn das Ubiquitin-System so bedeutsam ist und wir das Proteasom inhibieren, wird der Patient vielleicht nicht sterben, zumindest aber schwerwiegende Nebenwirkungen entwickeln. Doch es funktionierte, und zwar wie von Zauberhand, weil einige Zellen selbst für eine teilweise Inhibition empfindlicher sind als andere. Ich zeige es Ihnen – das ist das Medikament, Avram hat es gestern erwähnt, es handelt sich um Velcade, einen spezifischen Inhibitor der aktiven Seite des Proteasoms. Velcade ist ein Aldehydborsäure-Derivat und wird heute bei zwei Erkrankungen eingesetzt, obwohl es ein neues Medikament ist. Es wurde erst vor ein paar Jahren von der FDA zugelassen; seitdem expandiert seine Anwendung kontinuierlich. Hier haben wir einen Patienten mit einem multiplen Myelom. Für die Nicht-Hämatologen bzw. Nicht-Experten auf dem Gebiet unter Ihnen: Es handelt sich dabei um die monoklonale Expansion einer Immunzelle im Knochenmark. Die Immunzelle supprimiert alle normalen Vorläuferzellen im Knochenmark, die Krankheit ist daher tödlich. Es sind keine Vorläuferzellen mehr da, aufgrund des Drucks kommt es zu Wirbelfrakturen, Frakturen der Röhrenknochen; eine tödliche, eine wirklich sehr schlimme Krankheit. Wie Sie erkennen können, haben in diesem Fall die Onkologen Glück, denn sie können einem Biomarker folgen, was nicht bei vielen Krebserkrankungen möglich ist. Hier sehen Sie das von der Zelle sezernierte galoppierende Immunoglobulin, die konventionelle Behandlung beginnt, der Patient zeigt eine Teilresponse, erleidet ein Rezidiv, dann beginnt die Therapie mit dem Inhibitor und der Patient spricht gut darauf an. Bei etwa 5% der Patienten kam es zu einer bis dahin beispiellosen, langfristigen Remission. Die Herausforderung besteht nun darin, ein genetisches Profil dieser Patienten zu erstellen und die Unterschiede zwischen Respondern, Teil-Respondern und Non-Respondern zu verstehen. Das ist jedoch Aufgabe der heute in der modernen Medizin so bezeichneten personalisierten Medizin. Wir sind auf dem Weg von der allgemeinen Medizin zur personalisierten Medizin und werden Patienten und ihr Therapieansprechen eines Tages mit vollkommen anderen Augen betrachten. Hierbei handelt es sich um das Knochenmark des Patienten. Auch ohne ein Histo- oder Hämatopathologe zu sein, können Sie sofort erkennen, dass dieses Knochenmark maligne verändert ist, inhomogen, voller maligner Zellen. Im Anschluss an die Behandlung ist der Anteil der malignen Zellen, wie Sie sehen, von 40% auf 1% gesunken und das Knochenmark enthält wieder einen größeren Anteil normaler Vorläuferzellen. Das ist ein anderer Patient mit einem Non-Hodgkin-Lymphom, ebenfalls einer Erkrankung des Immunsystems. Ich möchte nicht auf die Einzelheiten eingehen, aber Sie sehen hier den Tumor im rechten Lungenhilus. Das sind die großen Gefäße, das Brustbein, die Wirbel, der Spinalkanal, das Schulterblatt, die Schultermuskulatur, die Rippen. Hier sehen Sie, wie sich der Tumor nach der Behandlung zurückgebildet hat. Gehen wir nun weiter und wenden uns der Zukunft zu. Ich möchte mit Ihnen in den letzten 5 Minuten meines Vortrags schnell noch einen Blick in die Welt von morgen werfen und Ihnen zeigen, wie wir sie uns vorstellen. Die Behandlung war also zunächst ganz klar unspezifisch und führte zur Zellapoptose. Es ergibt jedoch keinen Sinn, das Proteasom medikamentös zu beeinflussen und zu inhibieren, das wird bei vielen Erkrankungen nicht funktionieren. Man versucht daher derzeit verstärkt spezifische Therapien zu entwickeln, die ich Ihnen nun vorstelle. Wir wissen, dass einer der Qualitätskontrollmechanismen in der Zelle die Chaperone sind. Chaperone sind Proteine, die versuchen falsch gefaltete Proteine neu zu falten bzw., wenn ihnen dies nicht gelingt, sie an das Ubiquitin-System zu übergeben, wo sie abgebaut werden. Von Zeit zu Zeit spielen sie jedoch die falsche Rolle. Einerseits können sie die Proteine, die neu gefaltet werden sollen, nicht neu falten, andererseits binden sie sich irreversibel an sie und können sie nicht zum Abbau weiterleiten. Wir stecken also fest und die mutierten Proteine sind vor der Degradierung geschützt. Im Grunde genommen können wir sagen, dass diese HSP-Proteine, diese Chaperone als evolutionäre „Kondensatoren“ der Mutationen fungieren und sie verstärken. Die Idee ist nun, Dissoziatoren zu entwickeln, die die mutierten Proteine von ihrem Beschützer wegziehen. Genau das wurde gemacht, aktuell befinden sich bereits verschiedene Medikamente in der Testphase. Eines davon ist Geldanamycin, sehr toxisch, aber das Prinzip stimmt. Ein anderes Medikament ist 17-AAG; ich zeige Ihnen nur ein Beispiel. Wie Sie sehen, ist der HER-Neu-Rezeptor, das Target von Herceptin, hier fluoreszierend markiert; nach der Behandlung mit dem Chaperon-Dissoziator fluoresziert er nicht mehr, er wurde abgebaut. Hier können Sie die eigentliche Biochemie des Wirkmechanismus erkennen, wunderbar. Das ist der Rezeptor, das Protein, das ist die Aktivität des Rezeptors, die Tyrosinproteinkinase. Hier messen wir mit spezifischen Antikörpern, die Phosphortyrosin erkennen. Wie Sie sehen, steigt die Menge des Ubiquitinkonjugates, sobald wir die Konzentration des Dissoziators hier links erhöhen; der Rezeptor wird auf seine letzte Reise geschickt. Das Protein wird abgebaut, doch wirklich beeindruckend ist, dass auch die Aktivität sinkt. Die Phosphortyrosinkinase-Aktivität ist beinahe zum Stillstand gekommen. Wenden wir uns wieder den Patienten zu. Leider sind das jetzt einige nicht so schöne Krankheiten, aber wir sind schließlich in der Medizin. Das ist ein Patient mit einem Plattenepithelkarzinom, das sich auf das Gesicht ausgebreitet hat. Sie sehen, 40 Tage später sieht das Gesicht schon viel besser aus; es liegt nur noch ein Geschwür vor, der Tumor war ulzeriert, nekrotisiert. Es handelt sich also um eine mechanismus-basierte Therapie. Wir lösen ein mutiertes aktives Protein von seinem Kondensator ab, es wird abgebaut und dem Patienten geht es besser. Doch jetzt zu den Medikamenten der nächsten Generation. Das ist wirklich die Zukunft und die Tests am Menschen stecken noch in den Kinderschuhen. Ich möchte noch einmal auf p53 zurückkommen, denn p53 ist, wie ich Ihnen bereits sagte, ein außerordentlich wichtiges Protein. In 50% aller Tumorfälle ist es mutiert, in 50% der verbleibenden 50%, also in 25%, ist es unterrepräsentiert bzw. wird übermäßig abgebaut. p53 spielt also bei der malignen Transformation eine bedeutende Rolle. Bei jeder einzelnen Belastung, jeder Ribonukleotid-Verarmung, jeder DNA-Beschädigung, jedem Stickoxid steigt das p53 sprunghaft an. Wenn es nicht mutiert ist – ich spreche nur über den Wildtyp – stoppt es den Zellzyklus sofort, da eine gestresste Zelle nicht richtig arbeiten kann. p53 induziert die DNA-Reparatur bzw. Apoptose. Seneszenz ist hier kein Thema. p53 ist unser fleißiger Helfer; onkogener Stress erhöht bzw. aktiviert p53, Krebs zu verhindern. Das ist zwar ein bisschen vereinfacht ausgedrückt, aber genauso ist es. In denjenigen Fällen, wo p53 zwar als Wildtyp vorliegt, aber dennoch unterrepräsentiert ist, ist letzteres der Fall, weil seine Ubiquitinligase, sein „Henker“ überexprimiert wird. Im Prinzip wird Hdm2, die Ubiquitinligase, der „Henker“ von p53, zu einem Onkogen, das unkontrolliert heraufreguliert wird und p53 ubiquitiniert und degradiert. Es ist also sinnvoll, ein kleines Inhibitormolekül zu entwickeln, das diesen Teufelskreis durchbricht. Dann kann es uns egal sein, ob Hdm2 vorliegt, denn wenn dem so ist, wird es inhibiert. Genau das ist geschehen. Pharmafirmen entwickelten ein Medikament, einen Inhibitor namens Nutlin. Das Schöne daran ist, dass wir keine Tests mit hohem Durchsatz mehr brauchen und keine Bibliotheken mit zigtausend Verbindungen mehr überprüfen müssen – das Medikament ist maßgeschneidert. Maßgeschneidert deshalb, weil die dreidimensionale Struktur von Hdm2 bekannt ist; in diesem Fall ist es das Mausenzym Mdm2. In dieser Tasche sitzt das p53. Sie entwerfen ein kleines Molekül, das um den Platz in der Tasche konkurriert und ihn besetzt, so dass p53 nicht hinein kann und am Leben bleibt, also nicht ubiquitiniert und nicht abgebaut wird Und hier ist das Experiment. Sie sehen, dass, sobald wir Nutlin zusetzen, p53 ansteigt. Die Ligase steigt ebenfalls an, da sie ein p53 nachgeschaltetes Gen ist. Es interessiert uns nicht, dass die Ligase ansteigt, da sich Nutlin im Medium befindet. Jedes synthetisierte Mdm2-Molekül wird sofort von dem Medikament inhibiert. Tatsächlich können Sie sehen, dass der Zellzyklusinhibitor P21, bei dem es sich ebenfalls um ein p53 nachgeschaltetes Gen handelt, durch das aktive p53 induziert wird. Betrachtet man die Faktenanalyse, wird sofort deutlich, dass sich in nicht behandelten Zellen 45% der Zellen in einem Zyklus befinden und DNA synthetisieren; nach der Nutlin-Behandlung befinden sich 5% im Zellzyklus. Wir haben also 40% der Zellen aus dem Zellzyklus gedrängt. Das hier ist eine SCID-Maus, der 1 Million Tumorzellen injiziert wurden. Sie sehen, dass das Volumen des Tumors zunimmt. Das ist das Tumorvolumen, hier ist der Tumor behandelt. Eine Behandlungsmöglichkeit ist Doxorubicin, ein hochtoxisches, unspezifisches Chemotherapeutikum. Als DNA-Interkalator, als Oxyderivat des Nukleotids gelangt es in die DNA und verändert sie pathologisch. Hier können Sie einen ganz spezifischen Ubiquitinligaseinhibitor, in diesem Fall Nutlin, erkennen. Dieser hat dieselbe Wirkung wie ein hochtoxisches Breitband-Chemotherapeutikum. Wenn wir zu meiner Geschichte der Medikamente zurückkehren, ist eine Gradierung, also eine Abstufung erkennbar, keine Degradierung. Die Abstufung reicht von der unspezifischen Proteasombehandlung zur spezifischeren Chaperontherapie. Dennoch ist sie zu grob, denn es gibt viele Proteine, mit deren Hilfe eine ganz gezielte Behandlung der Ubiquitinligase möglich wäre, die aber durch Chaperone davon abgehalten werden. Das ist die Zukunft. Lassen Sie mich mit etwas schließen, das ich von Greg übernommen habe, nämlich dem Signieren. Im Nobel-Museum ist es übrigens üblich, dass die Preisträger auf Stühlen – der Unterseite von Stühlen – unterschreiben. Es unterschreiben aber nicht alle auf demselben Stuhl aus demselben Jahr. Man nimmt den Stuhl, lässt Sie unterschreiben und dann räumt man ihn für ein paar Jahre weg, um ihn dann wieder herauszuholen. Es dauert einige Jahre, bis die Unterseite des Stuhls vollgeschrieben ist. Hier habe ich fotografiert, wie Richard Axel den Stuhl signiert. Dann habe ich eine Aufnahme von dem Stuhl, auf dem ich unterzeichnet habe, gemacht. Dabei war ich so aufgeregt, dass mir nichts aufgefallen ist. Als ich dann nach Hause fuhr und mir das Foto ansah, fand ich, dass sich ein Kreis geschlossen hatte, ein sehr schöner Kreis. Hier habe ich unterschrieben. Dann schaute ich mir die beiden anderen an, die auch unterzeichnet hatten. Einer von ihnen ist ein sehr enger Freund von mir, den Sie hier schon gehört haben: Tim Hunt. Sie sehen Tim Hunt und Sie sehen den Zellzyklus, die Mitose. Das ist Tims Logo. Hier die Mitose, G1, der S-Pfad mit dem Mdm2, über den wir eben gesprochen haben, G2 – und hier steht Zellzyklus. Nun, für mich hat sich ein Kreis geschlossen, nicht nur weil Tim ein guter Freund ist, sondern der Zellzyklus vollständig vom Ubiquitin-System abhängt – sämtliche Inhibitoren, der Beschleuniger, P21, P27, Cyclin und die cyclin-abhängigen Kinaseinhibitoren. Avram hat Ihnen seine bemerkenswerte Arbeit hierzu gestern vorgestellt. Es geht also vom Prozess zum Mechanismus, und das verbindet mich mit meinem Ursprung. Der andere, der hier unterschrieben hat, ist Ahmed Zewail. Er ist seiner Abstammung nach Ägypter und arbeitet bei Caltech. Er ist ebenfalls Chemienobelpreisträger. Dass ich mich auf demselben Stuhl wie ein Ägypter wiederfinde, könnte zukunftsweisend sein. Vielleicht bedeutet über Wissenschaft zu reden, dass man auch über Frieden reden kann. Vielen Dank. Vielen Dank, das war ein sehr interessanter Vortrag. Jetzt haben wir noch Zeit für einige Fragen. FRAGE. Herr Professor, vielen Dank. Ich möchte Sie gerne bezüglich eines interessanten Phänomens bei einem anderen System etwas fragen. Wenn wir die Aktivität von Neuronen erhöhen, stellen wir fest, dass eine bestimmte Art von Proteinen vom Ubiquitin-Proteasom-System selektiv abgebaut wird, während bei einer Reduktion der Aktivität das Gegenteil der Fall ist. Meine Frage lautet also: Wie kann das Ubiquitinproteinsystem Ihrer Ansicht nach für den Abbau einer bestimmten Art von Proteinen präzise reguliert werden? Warum nicht für andere in denselben Zellen? Dankeschön. A. CIECHANOVER. Ok, Ihre Frage, wenn ich sie richtig verstanden habe, betrifft die Spezifität des Systems und die Frage, wie das Ubiquitin-System ein bestimmtes Substrat auswählt. Das hat in den meisten Fällen etwas mit dem Substrat selbst zu tun, aber auch mit den Elementen des Ubiquitin-Systems. Nehmen wir z.B. die nf-kappaB-Aktivierung, eine sehr wichtige Transkriptionsregulierung, die das Immunsystem reguliert und mit chronischen Entzündungen sowie Krebs in Zusammenhang steht. Sie ist außerdem stark anti-apoptotisch und wird durch das Ubiquitin-System aktiviert. Nach der Signalgebung durch, sagen wir, TNF alpha werden ganz spezifische Seringruppen auf dem Molekül, dem Inhibitor des Moleküls – I kappa B alpha und I kappa B beta – phosphoryliert. Diese beiden spezifischen Phosphorylierungen, die drei Aminosäuren auseinanderliegen, also Threonin 32 und Threonin 36, werden von einer sehr spezifischen Ubiquitinligase spezifisch erkannt. Nur dieses Protein mit diesen beiden Serinen wird in diesem Moment markiert, alle anderen Proteine nicht. Dasselbe geschieht bei p27, wie man der Arbeit von Michele Pagano und Avram entnehmen kann. p27, ein Zellzyklusinhibitor, wird auf Threonin 187 phosphoryliert, und erst nach dieser Phosphorylierung kommt eine spezifische Ubiquitinligase namens SKIP2 und entfernt ihn. Das bedeutet nicht, dass die Phosphorylierung einfach zwei Beispiele für die Phosphorylierung und dafür, wie Phosphorylierung und Signalgebung dem Ubiquitin-System zuarbeiten, aufgegriffen hat, doch es gibt viele Signale. Nehmen Sie z.B. HIF-1 alpha bei der Sauerstofferfassung, die wunderbare Arbeit von Bill Kaelin aus Harvard und Peter Ratcliffe aus Oxford. Wenn wir uns in einer normoxischen Umgebung unter hohem Sauerstoffdruck befinden, müssen wir für eine Vaskularisierung normalerweise nicht all diese sauerstoffempfindlichen Gene wie VGF und VGF-Rezeptor induzieren, weil wir über genügend Sauerstoff verfügen. Diese endogene VGF- und VGF-Rezeptor-Reaktion wird nur bei niedrigem Sauerstoff stimuliert. Die Regulation erfolgt über ein Protein namens HIF-1 alpha oder Hypoxie-induzierbarer Faktor; es handelt sich um eine äußerst wirksame Transkriptionsregulation. Unter hypoxischen Bedingungen wird dieses Protein ständig oxidiert. Nach der Oxidierung auf einem spezifischen Prolinrest kommt eine spezifische Ubiquitinligase namens Von Hippel-Lindau-Protein und entfernt es, da es das spezifische Prolin, Hydroxyprolin erkennt. Bei niedrigem Sauerstoff findet keine Hydroxylierung statt, HIF-1 alpha steigt an und induziert alle nachgeschalteten Gene. Ich habe versucht Ihnen zwei Beispiele zu geben, aber das Geheimnis liegt immer in der spezifischen Erkennung; deswegen benötigen wir diese riesige Palette an Ubiquitinligasen. FRAGE. Können Sie uns etwas über den Prionenabbau sagen? A. CIECHANOVER. Prionenabbau – Stanley Prusiner sollte hier sein und Ihnen etwas darüber erzählen. Prionen sind extrazellulär, gelangen aber in die Zelle und stehen mit dem Ubiquitin-System in Zusammenhang. Ich kann nur auf eine wunderbare Arbeit verweisen, die noch nicht fertiggestellt ist und die uns noch nicht vorliegt; es geht darin um die Sezernierung des Prions auf seinem Weg nach draußen und im Zusammenhang damit auch um das Proteasom. Die Autorin, Susan Lindquist vom Whitehead Institute in Boston, behauptet, dass infolge der Inhibition des Proteasoms in gewisser Weise auch das Prion akkumuliert und vielleicht sogar die Umwandlung des PrPC- in das PrPsc-Partikel induziert und damit die Prionenkrankheit auslöst wird. Krank sein ist nicht schön, aber man muss schließlich das kleinere Übel wählen. Möchten Sie an der Prionenkrankheit sterben oder am multiplen Myelom – ich weiß nicht, ich finde, das ist eine schlechte Wahl. Aber wir realisieren offensichtlich den vollen Umfang immer noch nicht, denn das Ubiquitin-System ist so komplex und an so vielen Prozessen beteiligt, dass wir seine Konsequenzen nicht verstehen. Vielen Dank.

Abstract

Between the sixties and eighties, most life scientists focused their attention on studies of nucleic acids and the translation of the coded information. Protein degradation was a neglected area, considered to be a non-specific, dead-end process. While it was known that proteins do turn over, the large extent and high specificity of the process - whereby distinct proteins have half-lives that range from a few minutes to several days - was not appreciated. The discovery of the lysosome by Christian de Duve did not significantly change this view, as it was clear that this organelle is involved mostly in the degradation of extracellular proteins, and their proteases cannot be substrate-specific. The discovery of the complex cascade of the ubiquitin pathway revolutionized the field. It is clear now that degradation of cellular proteins is a highly complex, temporally controlled, and tightly regulated process that plays major roles in a variety of basic pathways during cell life and death, and in health and disease.

With the multitude of substrates targeted, and the myriad processes involved, it is not surprising that aberrations in the pathway are implicated in the pathogenesis of many diseases, certain malignancies and neuro-degeneration among them. Degradation of a protein via the ubiquitin/proteasome pathway involves two successive steps: (a) conjugation of multiple ubiquitin moieties to the substrate, and (b) degradation of the tagged protein by the downstream 26S proteasome complex. Despite intensive research, the unknown still exceeds what we currently know on intracellular protein degradation, and major key questions remain unsolved. Among these are the modes of specific and timed recognition for the degradation of the many substrates, and the mechanisms that underlie aberrations in the system that lead to pathogenesis of diseases.

The recent discovery of modification by ubiquitin-like proteins along with identification of “non-canonical” polyubiquitin chains that serve non-proteolytic functions, have broadened the scope of the system beyond proteolysis and set new challenges in for biologists and proteomic experts. Major challenges in the field are clearly (i) identification of the cellular proteins tagged by ubiquitin and ubiquitin-like proteins, (ii) identification of the downstream elements recognized by these chains, and (iii) deciphering the structure of the different ubiquitin and ubiquitin-like chains that tag the different proteins.